[发明专利]一种检测槟榔黄化病植原体病原的方法及其专用试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测槟榔黄化病植原体病原的方法及其专用试剂盒，适合于检疫、农业生产、植物保护等部门使用。

背景技术

槟榔(Areca cathecu L.)是我国重要的南药资源之一，据海南省农业厅统计，截至2006年底，海南省槟榔种植面积达5.31万公顷，收获面积2.33万公顷，总产量7.48万吨，产值18亿元以上。

槟榔黄化病是一种毁灭性病害，最早在印度的Kerala中部发生，到20世纪60年代，印度Kerala邦的Quilon地区槟榔黄化病已经普遍发生。1981年，槟榔黄化病首次在我国海南省药材场(屯昌县)发现；上世纪90年代初，海南岛内的部分槟榔种植区相继开始发现黄化病的为害；据2006年调查，槟榔黄化病除在海南屯昌县发生外，已蔓延到琼海、万宁、陵水、三亚、保亭等县市的成片槟榔园中，严重威胁着海南省槟榔产业的发展。

槟榔黄化病在田间的症状表现为：发病初期，植株下部倒数第2～4张羽状叶片外缘1/4开始出现黄化，抽生的花穗较正常植株短小，无法正常展开，结果量大大减少，常常提前脱落，减产70～80％，少量存留的果实品质严重降低，无法食用。节间缩短，感病植株叶片黄化症状逐年加重，干旱季节黄化症状更为突出，整株叶片无法正常舒展生长，解剖可见病叶叶鞘基部刚形成的小花苞水渍状败坏，严重时呈暗黑色，花苞基部有浅褐色夹心；感病后期病株根茎部坏死腐烂，大部分感病植株开始表现黄化症状后5～7年枯顶死亡。槟榔生理性黄叶是由于槟榔园管理不善，缺肥或干旱引起，槟榔叶片发黄现象呈现区域性，成片发生，一般是下部叶片均匀黄化，严重的干枯死亡，而黄化病则有明显的发病中心，即在槟榔园开始发病时仅少量植株有黄化的表现。通过大田流行规律调查、电子显微镜观察、四环素族抗菌素注射诊断等研究表明，植原体(Phytoplasma)是导致海南槟榔发生黄化病的病原(罗大全，陈慕容，叶沙冰，蔡希灼.海南槟榔黄化病的病原鉴定研究.热带作物学报，2001，22(2)：43-46.)。

植原体(phytoplasma)，原称类菌原体(mycoplasma-like organism，MLO)，为单细胞原核生物，无细胞壁，由生物膜包围，隶属于细菌界(Bacteria)，硬壁菌门(Firmicutes)，柔膜菌纲(Mollicutes)(又称软球菌纲)，非固醇菌原体目(Acholeplasmatales)，非固醇菌原体科(Acholeplasmataceae)。定殖于植物韧皮部筛管以及刺吸式介体昆虫的肠道、淋巴、唾腺等组织内，植原体通常在植物体中含量较低，难以人工培养，且分布不均匀。研究者们根据植原体的16SrDNA序列对植原体进行分类，将已报道的植原体分为14个组38个亚组，其中翠菊黄化组(AY组，16Sr I)是植原体中包含植原体数量最多的组，被分为6个亚组，(Lee I M，Davis R E，Gundersen-Rindal D E.Phytoplasma：Phtopathogenic Mollicutes.Annual Review Microbiology，2000，54：221-255)。

植原体在世界范围内引起多种经济上重要的植物病害，如：椰子致死黄化病、枣疯病等。植原体病害主要通过无性繁殖材料、种苗或昆虫介体传播，很少或不能种子传毒，目前尚无很好的防治办法，唯有通过设立和建设无病区、加强植物检疫严防病害蔓延和扩散，因此病害的早期诊断和疫情监测对于病害的检验检疫和防范控制具有重要意义。植原体病害的检测目前主要有电子显微镜法，组织化学技术，血清学方法，核酸杂交技术，PCR技术等，特别是根据16SrDNA设计广谱引物和特异性引物对植原体进行PCR检测，已被广泛应用，在植原体的研究中有了历史性的进步。但上述这些方法整个过程繁杂，操作步骤多，需要消耗大量的时间，不适合大批量的样品检测，如琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色，紫外光观察结果或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测，如果要鉴定到种或组，还要进行限制性内切酶多态性分析(RFLP)，或者进行核酸序列测定和同源性比较，不仅需要多种仪器，而且费时费力，所使用的染色剂溴化乙锭对人体又有害，这些繁杂的实验过程又给污染和假阳性提供了机会，严重影响对结果的正确判断。