[发明专利]狂犬病毒CTN株全基因组感染性cDNA克隆及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种狂犬病毒，更具体地说是利用反向遗传技术拯救重组狂犬病毒，属于生物工程领域。

背景技术

狂犬病(RV)是由狂犬病毒引起的一种人畜共患病，病死率几乎高达100％。该病流行于100多个国家和地区，全世界每年因狂犬病死亡的人数达55000人，印度是狂犬病流行最严重的国家，其死亡人数占一半；中国的狂犬病例数仅次于印度，占世界第二位。狂犬病毒具有神经嗜性，在动物机体内的感染可以分为向心性扩散和离心性扩散两个过程。前者即病毒从入侵部位通过神经-肌肉接头或神经传感器侵入外周神经，再沿脊髓到达中枢神经系统，导致脑脊髓炎；后者即离心性扩散，是病毒从中枢神经向周围神经系统扩散，导致临近某些非神经系统的感染，特别是受神经系统高度支配的器官，因此最终不可避免地发展为全身神经系统的衰竭和死亡，具体的致病机理尚不明确。

反向遗传技术是20世纪末新兴起来的一种技术，即从克隆的质粒中拯救出具有感染活性的病毒。此技术可以用于制造弱毒活疫苗用于野生动物的免疫，效果很好，在欧美国家应用较多，所以在这些国家野生动物狂犬病得到了很好的控制。1994年，Schell等首次建立了狂犬病毒的反向遗传学，成功拯救了SADB19株狂犬病毒，此后相继用此方法成功拯救出其他两株RC-HL，HEP-Flory和ERA株狂犬病毒。

目前，对狂犬病尚无有效的治疗方法，免疫接种疫苗是预防狂犬病的最有效措施之一。现有的狂犬病毒疫苗主要是灭活疫苗，用于人的免疫，对于动物的免疫或者野生动物的免疫依然存在漏洞和不足，由于灭活疫苗为注射型疫苗，对于野生散养动物的免疫并不实用，而且面临动物疫苗生产成本高，用于野生动物免疫费用昂贵等问题。

在反向遗传系统中，获得基因组转录后精确的5’和3’末端是通过在其全长基因组3’和5’末端添加具有自我切割活性的HamRz和HdvRz实现的。而狂犬病病毒全长基因组有12kb，不可能一次完成扩增，所以全长基因的扩增都采用分段扩增的方法。预在基因组cDNA的5’端加入锤头状核酶序列，就将锤头状核酶序列直接设计在第一个基因片段的上游引物中；同样，预将丁型肝炎核酶序列添加在基因组cDNA序列的3’末端，就将丁型肝炎核酶的序列设计在最后一个基因片段的下游引物中。

这种设计必然存在一些问题。首先，HamRz和HdvRz的活性中心最小结构分别包括45nt和85nt，这么长的引物必会造成上下游引物长度不匹配；引物之间GC％失调；引物之间二聚体、发夹结构不可避免；其次，由于上下游引物长度的差距，很难找到合适的退火温度，PCR反应条件也难于优化。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种狂犬病毒CTN株全基因组感染性cDNA克隆。

本发明的另一目的是提供一种上述狂犬病毒cDNA克隆的制备方法。

本发明的又一目的是提供上述方法中使用的扩增引物及表达载体。

为了实现上述目的，本发明思路为：

本发明利用CTN株狂犬病病毒全长基因组内的单一限制性酶切位点将病毒全长分成四段进行扩增，在扩增同时去除伪基因处423bp碱基，代之以绿色荧光蛋白基因，最后克隆入pVAX-R表达载体，载体序列如SEQ ID No.24所示；构建成病毒基因组全长质粒。pVAX-R载体为pVAX1载体的改造体，即将pVAX1载体的多克隆酶切位点处切除，代之以锤头状核酶、由9个限制性酶切位点组成的linker、丁型肝炎核酶序列。另外，用RT-PCR扩增CTN株狂犬病病毒的核蛋白(N)，磷蛋白(P)，糖蛋白(G)，转录大蛋白(L)基因序列，并将扩增片段直接克隆入pVAX1载体中，构成反向遗传系统中的4个辅助质粒。最后将这5个质粒共同转染BHK-21细胞，最终拯救狂犬病病毒，得到狂犬病毒CTN株全基因组感染性cDNA克隆。

CTN株狂犬病病毒全长基因组包括11923个核苷酸，(Genbank编号EF564174)

本发明的具体技术方案为：

狂犬病毒CTN株全基因组感染性cDNA克隆，该cDNA克隆的核酸序列为SEQ IDNo.1所示。

一种狂犬病毒CTN株全基因组感染性cDNA克隆的制备方法，其包括下列步骤：