[发明专利]玉米细菌性萎蔫病菌生物素-亲和素酶联免疫检测方法

权利要求书

1、一种抗玉米细菌性萎蔫病菌多克隆抗体，其特征在于：所述多克隆抗体效价在1 x 10^-4以上；所述多克隆抗体的特异性，其与2株玉米细菌性萎蔫病菌(ATCC 27822，ATCC 33114)表现强烈反应，而与相关的其他11个病原细菌种或亚种无交叉反应。

2、权利要求1所述的抗玉米细菌性萎蔫病菌多克隆抗体制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)制备免疫原：玉米细菌性萎蔫病菌菌株(来自美国菌种保藏中心ATCC)接种于液态NBY培养基上，28℃下恒温振荡培养；在细菌生长对数期收集菌体，12000g离心10分钟，倒去上清液，菌体用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)复溶，反复离心清洗三次后再加入无菌PBS复悬；用比浊法计数并定溶细菌菌体浓度到1 x 10⁸～1 x 10⁹cfu/mL；

(2)动物免疫：取上述菌悬液按常规免疫方法对供试家兔进行免疫操作，定期采集血清，并分装后置于-20℃下保存备用；

(3)纯化抗体：从上述血清中筛选出效价表现最高的抗血清(效价在10^-4以上)进行纯化，浓度定溶为1.0mg/mL，即得抗玉米细菌性萎蔫病菌多克隆抗体。

3、根据权利要求2所述的抗玉米细菌性萎蔫病菌多克隆抗体制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中抗血清的纯化方法为硫酸铵沉淀法和Protein A柱亲和层析法。

4、一种玉米细菌性萎蔫病菌生物素-亲和素酶联免疫检测方法，其特征在于：将权利要求1所述的多克隆抗体进行生物素标记；制备样品提取液或细菌悬浮液，并包被在微孔板上；之后相继加入生物素标记抗体、碱性磷酸酶标链霉亲和素和PNP底物，显色后用酶标仪读取波长在405nm下的吸光度值。

5、根据权利要求4所述的玉米细菌性萎蔫病菌生物素-亲和素酶联免疫检测方法，分设阴性和阳性对照，其特征在于：以健康玉米组织悬浮液作为阴性对照，玉米细菌性萎蔫病菌悬液作为阳性对照进行ELISA检测。

6、根据权利要求5所述的玉米细菌性萎蔫病菌生物素-亲和素酶联免疫检测方法，其特征在于：其检测灵敏度达到1 x 10⁶cfu/mL。

7、根据权利要求6所述的玉米细菌性萎蔫病菌生物素-亲和素酶联免疫检测方法，其特征在于：所述抗体进行生物素标记的方法为：取1mL抗体(IgG，1.0mg/mL)用交联缓冲液4℃下透析过夜，期间换3次缓冲液；加入100ul标记试剂在室温下反应30min，加入100ul1MTris/HCl终止反应；然后用0.85％NaCl缓冲液4℃下透析过夜，期间换3次缓冲液，得到标记好的生物素抗体；其中所用的标记试剂为1mg生物素与1mL二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO)充分溶解得到的。

8、根据权利要求7所述的玉米细菌性萎蔫病菌生物素-亲和素酶联免疫检测方法，其特征在于：所述样品提取液的制备方法为：取30g玉米籽粒样品用无菌水冲洗3次，在300ml碳酸缓冲液(CBS)中浸泡过夜，然后将种子研磨破碎，获得浓度为0.1g/mL的玉米组织悬浮液；所述菌悬液的制备方法为：将玉米细菌性萎蔫病菌和培养基的冻干粉用无菌水制备成1 x 10^8-9cfu/mL的菌悬液，将等体积的此菌悬液与上述玉米组织悬浮液混合，形成5×10⁸cfu/mL样品液，再通过倍比稀释分别配成1 x 10⁸，5×10⁷，10⁷，5×10⁶，10⁶，5×10⁵，10⁵cfu/mL的菌悬液。

9、一种根据权利要求4所述的检测方法组建的玉米细菌性萎蔫病菌生物素-亲和素酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：供200孔检测用，使其包含下述组分：

A、检测抗体：权利要求1所述的经生物素标记的玉米细菌性萎蔫病菌多克隆抗体；

容量：0.125mL   使用浓度：0.1mg/mL    稀释倍数：1:200

含量：0.5ug/mL    防腐剂：0.05％NaN₃  贮藏：4℃下6个月

B、酶标链霉亲和素复合物；

容量：0.05mL(含0.05％NaN₃)稀释倍数：1:500贮藏：4℃下6个月

C、10倍PBST浓缩液：1:10稀释后，用于稀释检测抗体、酶标链霉亲和素和洗涤酶标板；

规格：60mL/瓶   贮藏：室温

D、10倍碳酸盐缓冲液(CBS)：1:10稀释后，用于样品提取和封闭液配制；

规格：60mL/瓶   贮藏：室温

E、封闭液：用CBS配制的0.5％(w/v)BSA或2％(w/v)脱脂奶粉；

F、底物：对硝基苯磷酸盐(PNPP)片剂：5mg/片；

G、5倍底物缓冲液：1：5稀释后，用于配制显色液，pH9.8；

组分：0.5mol/L二乙醇胺缓冲液

规格：10mL/瓶    贮藏：室温

H、显色液：用底物缓冲液配制的PNPP溶液，1mg/mL，现配现用；

I、终止液：2M NaOH溶液；

规格：50mL/瓶    贮藏：室温

J、阳性对照：玉米细菌性萎蔫病菌和培养基的冻干粉；

K、阴性对照：健康玉米籽粒粉。