[发明专利]玉米细菌性萎蔫病菌生物素-亲和素酶联免疫检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶联免疫检测方法，特别是涉及一种玉米细菌性萎蔫病菌生物素-亲和素酶联免疫检测方法及检测试剂盒。

背景技术

玉米(内州)萎蔫病又称玉米细菌性萎蔫病(Goss’s bacterial wilt and blight of maize，Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis)，是一种可以造成严重玉米损失的植物病害。1969年，该病首次在美国内不拉斯加州道森县发生，之后陆续蔓延到克罗拉罗州、伊利诺斯州、爱荷华州、肯萨斯州、密歇根州、明尼苏达州，内布拉斯加州、南达科他州和威斯康星州，至2000年已经扩散至加拿大的安大略湖区。萎蔫病的危害性和分布区域的扩张蔓延引起人们的高度重视，欧盟、加拿大等国都已经建立了该病的风险评估体系。我国于2007年5月将该病菌列入最新修订的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。

玉米细菌性萎蔫病有两种主要表现形式，一为叶片萎蔫，二为系统枯萎。该病在叶片上最初为不连续的水渍状斑点，初为暗绿色至黑色，后变褐色，与叶脉平行，表面常有细菌溢脓。系统侵染时，维管束变色，根和近地面的茎秆干腐或水渍状褐腐。玉米幼苗和成株均可发病。细菌通过伤口侵染，也可直接通过叶片侵染或者细嫩植株的根和茎秆系统侵染引起发病。苗期侵染引起萎蔫、死亡，后期侵染造成植株矮化，叶片上出现灰白色或黄绿色条纹，条纹边缘波浪形或不规则形，有时有黑色斑点，最后干枯。

酶联免疫吸附方法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是实施生物检测(涉及包括人类病原菌，动植物病原菌，生物毒素，农兽药残留，蛋白质，DNA等多种/类生物体和化合物)的最为行之有效和重要的手段之一。鉴于生物素-亲和素反应体系的高亲和力和高特异性，近些年在ELISA检测中得到广泛重视。目前，国内外尚未见玉米细菌性萎蔫病菌ELISA检测研究的报道，建立灵敏、稳定的玉米细菌性萎蔫病菌生物素-亲和素ELISA检测方法(biotin-avidin ELISA)是玉米检疫的迫切要求。

发明内容

本发明的目的是建立一种满足特异性和高灵敏的多克隆抗体的玉米细菌性萎蔫病菌生物素-亲和素酶联免疫检测方法，并研制出试剂盒，为玉米细菌性萎蔫病菌检测提供一种高效、简便的技术手段。

一种抗玉米细菌性萎蔫病菌多克隆抗体，所述多克隆抗体的效价在10^-4以上；所述多克隆抗体采用间接ELISA法测定其特异性，其与2株玉米细菌性萎蔫病菌(ATCC 27822，ATCC33114)表现强烈反应，而与相关的其他11个病原细菌种或亚种无交叉反应，供试细菌菌体浓度为1x10^8-9cfu/mL。

本发明的抗玉米细菌性萎蔫病菌多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：(1)制备免疫原：供试的玉米细菌性萎蔫病菌接种于液态NBY培养基上，28℃下恒温振荡培养，在细菌生长对数期收集菌体；12000g离心10分钟，倒去上清液，菌体用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)复溶，反复离心清洗三次后再加入无菌PBS复悬，比浊法计数并定溶菌体浓度到1x10⁸～1x10⁹cfu/mL，制得细菌菌体悬液；

(2)动物免疫：取上述菌悬液按常规免疫方法对供试家兔进行免疫操作后，采集血清，并分装后于-20℃下保存；

(3)纯化抗体：从上述血清中筛选出效价表现最高的抗血清(效价在10^-4以上)进行纯化，抗体浓度定溶为1.0mg/mL，即得抗玉米细菌萎蔫病菌多克隆抗体。

本发明的抗玉米细菌性萎蔫病菌多克隆抗体的制备方法，所述步骤(3)中抗血清的纯化方法为硫酸铵沉淀法和Protein A柱亲和层析法。

一种玉米细菌性萎蔫病菌生物素-亲和素酶联免疫检测方法，包括以下步骤：将上述的多克隆抗体进行生物素标记，制备样品提取液或菌悬液，然后在微孔板上包被样品提取液或菌悬液，之后相继加入生物素标记抗体、碱性磷酸酶标链霉亲和素和PNP底物，显色后用酶标仪读取波长在405nm下的吸光度值。

其中所述检测方法以健康玉米粉悬浮液作为阴性对照，玉米细菌性萎蔫病菌悬液作为阳性对照进行ELISA检测。样本吸光度值与其所含玉米细菌性萎蔫病菌含量成正相关，采用P/N≥2.0作为阳性结果的判定标准。

其检测灵敏度达到1x10⁶cfu/mL。