[发明专利]一种自然杀伤细胞及其培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种自然杀伤细胞及其培养方法。

背景技术

用于肿瘤治疗的细胞免疫治疗比其它细胞治疗方案较早进入临床，在已试用的方案中，LAK细胞、CIK细胞和A-NK细胞均是NK细胞为主导的抗癌体系，这是因为自然杀伤细胞(natural killer，NK)是主要的天然免疫成员，在防御疾病包括恶性肿瘤第一防线中能发挥重要作用。与获得性免疫系统的细胞(例如T细胞)相比，NK细胞无需预先刺激或致敏即可启动细胞毒活性，从而提供即时的自然反应。NK细胞对肿瘤的杀伤优势表现为直接溶解和分泌细胞因子二个方面，其杀伤肿瘤既可通过穿孔素又可通过FAS配基。NK细胞可以产生TNF-α、IFN-γ和IL-1，这些细胞因子在NK细胞抗癌反应以及调动T淋巴细胞中有十分重要地位。由于NK细胞具有快速的杀伤作用和广泛的靶细胞，提示NK细胞可以用于治疗恶性肿瘤。研究证明，过继转输体外活化、扩增自体或同种异体NK细胞对治疗多种白血病和实体瘤有效。

NK细胞用于肿瘤治疗是通过体外制备对肿瘤细胞具有杀伤功能的NK细胞，再经过一系列处理(如辐照、细胞因子刺激等)后输注给患者，在患者体内实现对肿瘤细胞的杀伤，达到治疗效果。

获得足够数量的、杀伤活性强、质量稳定的NK细胞，是实现NK细胞临床应用的关键。但是由于来源于外周血的NK细胞难以在体外大量扩增，而且从外周血中分离纯化NK细胞有一定的技术难度，难以避免T淋巴细胞的污染，无法获取大量均一的NK细胞并达到临床所需的标准，故NK细胞还不能广泛应用于临床；另外，在有些病例中，NK细胞介导的抗肿瘤反应弱，可能与NK细胞杀伤能力、在体内存活能力差或向肿瘤部位迁移受限等因素有关。

因此，寻找活性强的NK细胞及建立体外大规模培养体系是NK细胞过继免疫治疗肿瘤在临床的应用中亟需解决的问题。建立易于操作、质量可控、产量高、产物活性高、成本低的NK细胞系大规模连续培养及制备工艺可解决细胞免疫治疗技术所面临的瓶颈难题，使细胞治疗产品有可能像药物一样批量化、规模化、均一化、流程化生产。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于治疗肿瘤的自然杀伤(NK)细胞。

本发明所提供的自然杀伤(NK)细胞为人自然杀伤细胞NKG细胞，该细胞株已于2009年2月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.2901。

本发明的另一个目的是提供一种培养上述NKG细胞的方法。

本发明所提供的培养上述NKG细胞的方法是用细胞培养基培养NKG细胞；所述细胞培养基可以是含终浓度为1.5mM-2.5mM的L-谷氨酰胺、终浓度为2.0g/L-2.4g/L的碳酸氢钠、终浓度为5.0mg/L-9.0mg/L的核糖核苷、终浓度为5.0mg/L-9.0mg/L的脱氧核糖核苷、终浓度为8.0％-12.5％(v/v)的新生牛血清、终浓度为8.0％-12.5％(v/v)的马血清、终浓度为5.0×10⁴IU/L-1.25×10⁵IU/L的人白细胞介素2等成分的α-MEM液体培养基；所述终浓度为各物质在所述细胞培养基中的浓度。

所述核糖核苷为A和G和C和U的混合物；所述脱氧核糖核苷为dA和dG和dC和dT的混合物。

所述细胞培养基可优选为如下培养基：含终浓度为2.0mM的L-谷氨酰胺，终浓度为2.2g/L的碳酸氢钠，终浓度为7.0mg/L的核糖核苷，终浓度为7.0mg/L的脱氧核糖核苷，终浓度为10％(体积百分比)的新生牛血清，终浓度为10％(体积百分比)的马血清，终浓度为1.0×10⁵IU/L的人白细胞介素2的α-MEM液体培养基；所述终浓度为各物质在所述细胞培养基中的浓度；所述核糖核苷为A和G和C和U；所述脱氧核糖核苷为dA和dG和dC和dT。

所述培养中，所述培养的方式可为摇袋式培养；所述摇袋式培养的摆动速度可为4rpm-10rpm，摆动幅度可为3°-9°；所述摆动速度优选为7rpm，所述摆动幅度优选为7°。

所述培养的条件可为温度为35℃-37℃、空气中CO₂体积含量可为4.0％-10.0％、CO₂流速可为0.10L/min-0.25L/min；所述温度优选为37℃，所述空气中CO₂体积含量优选为5.0％，所述CO₂流速优选为0.15L/min。