[发明专利]快速筛选高表达目的蛋白的酵母的方法

说明书

技术领域

本发明涉及快速筛选高表达目的蛋白的酵母的方法。

背景技术

甲醇营养型酵母(简称甲醇酵母)是最近十年逐渐发展起来的一种可用于表达 外源基因特别是真核生物基因的理想系统。这类酵母分属假丝酵母(Canda)，汉逊 酵母(Hansenula)，毕赤酵母(Pichia)和球拟酵母(Torulopsis)4个属，它们都能 在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基上生长。与酿酒酵母相比，甲醇酵母具有遗传 性质稳定、表达量高、分泌效率高和适于大规模发酵等优点。多形汉逊酵母 (Hansenula)是这类酵母中的佼佼者，是当前国际上公认的最为理想的外源基因表 达系统之一。目前已构建了多种多形汉逊酵母营养型突变体菌株和相应的携带这些 突变体功能互补的同源或异源基因的载体。同时，G418、腐草霉素或零霉素抗性的 基因也被作为筛选标记基因应用于多形汉逊酵母表达系统中。

多数蛋白质的表达存在基因剂量效应，外源基因高拷贝重组菌往往能提高外源 蛋白的产量，不同筛选标记和筛选方法在多拷贝高表达重组菌的筛选中起到至关重 要的作用。常用的筛选标记主要有抗性筛选(例如：G418和腐草酸素)和营养缺陷 型筛选(例如：LEU2或URA3)。利用转化子对G418和腐草酸素的抗性程度筛选重 组菌，虽然能够筛选高拷贝转化子。但是存在操作繁琐，成本高，基因容易丢失等 缺点。利用酿酒酵母的LEU2或URA3基因作为选择标记，尽管能应用无机培养基在 发酵整个过程中给予压力避免外源基因丢失，但是其拷贝数相对较低，存在操作繁 琐(培养基配制)，筛选工作量大，成本高等缺点。而且有时高拷贝不一定高表达。 总体来说，以上常用的筛选方法很难实现目的蛋白高表达重组菌的快速筛选。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速筛选高表达目的蛋白的酵母的方法。

该方法是基于将酸性α-淀粉酶的编码基因作为筛选标记基因。

将酸性α-淀粉酶的编码基因作为筛选标记基因，首先需要构建以所述酸性α- 淀粉酶的编码基因作为筛选标记的出发载体，然后将外源基因插入到所述的出发载 体中，获得以酸性α-淀粉酶的编码基因作为筛选标记的重组表达载体，将该载体 导入宿主细胞中，在含有淀粉的固体培养基中培养，所述酸性α-淀粉酶水解淀粉 产生的透明圈，通过淀粉显色可以直观的根据透明圈半径大小简便快捷初步筛选目 的蛋白高表达阳性克隆。

以所述酸性α-淀粉酶的编码基因作为筛选标记的出发载体，包含原核复制起 点、筛选标记基因表达盒和目的基因表达盒；所述外源基因表达盒自上游至下游依 次含有启动子、目的基因和终止子；所述筛选标记基因表达盒自上游至下游依次含 有启动子、酸性α-淀粉酶的编码基因和终止子。

其中，所述筛选标记基因表达盒还可含有两个loxP序列；所述酸性α-淀粉酶 的编码基因位于所述两个loxP序列之间，在Cre重组酶的作用下可有效去除酸性 α-淀粉酶的编码基因。所述载体还可含有血红蛋白基因表达盒，所述血红蛋白基 因表达盒自上游至下游依次含有FMD启动子、血红蛋白基因序列和终止子，所述FMD 启动子的核苷酸序列可为序列表中的序列1，所述血红蛋白基因的核苷酸序列可为 序列表中的序列2。血红蛋白基因表达盒可以表达血红蛋白，在贫氧情况下，含有 血红蛋白的重组菌可以高效表达目的蛋白，更利于工业生产。

所述载体还含有抗性基因表达盒，所述抗性基因表达盒自上游至下游依次含有 loxP序列、抗性基因和loxP序列。所述抗性基因为Zeocin抗性基因。

所述载体的结构如图3所示。

本发明所提供的快速筛选高表达目的蛋白的酵母的方法，包括如下步骤：

将上述的载体导入酵母菌中获得重组菌，所述重组菌在含有可溶性淀粉的固体 培养基上培养，单克隆周围产生直径为0.3-1.0em透明圈的重组菌为高表达目的蛋 白的酵母。

其中，所述方法中，还包括将Cre重组酶基因导入所述重组菌中。

将Cre重组酶基因导入重组菌中可用本领域已知的多种方法，如将 pHFMD-ZL2R1A-Cre(+)载体导入重组菌中，pHFMD-ZL2R1A-Cre(+)的结构如图5所示， Cre重组酶基因导入重组菌表达Cre重组酶，Cre重组酶可将抗性基因和酸性α-淀粉 酶的编码基因去除，得到的重组菌不含有筛选标记基因，使重组菌成为食品级产品。