[发明专利]一种猪肺炎支原体检测试剂盒及其应用

权利要求书

1.检测猪肺炎支原体的专用引物，由以下三对环介导等温扩增所用引物组成：一对引物是能结合于猪肺炎支原体基因组GenBank Accession Number NC-006360中自5′末端第876699至876919位核苷酸区域的内侧引物对，一对引物是能结合于猪肺炎支原体基因组GenBank Accession Number NC-006360中自5′末端第876699至876919位核苷酸区域的外侧引物对，一对引物是能结合于猪肺炎支原体基因组6enBankAccession Number NC-006360中自5′末端第876699至876919位核苷酸区域的环形引物对；

所述内侧引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列4，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列5；所述外侧引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列2，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列3；所述环形引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列6，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列7。

2.含有权利要求1所述专用引物的猪肺炎支原体检测试剂盒。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括环介导等温扩增试剂和检样管；所述检样管为含FTA卡片的离心管。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述环介导等温扩增试剂为含有如下溶质的水溶液：Tris-HCl、KCl、(NH₄)₂SO₄、Tween20、MgSO₄、甜菜碱、钙黄绿素、MnCl₂、脱氧核苷酸、Bst DNA聚合酶。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：在所述环介导等温扩增试剂中加入所述内侧引物对、所述外侧引物对及所述环形引物对，形成环介导等温扩增反应液；每23μL所述环介导等温扩增反应液中，含有如下溶质：

Tris-HCl 0.5μmol、KCl 0.25μmol、(NH₄)₂SO₄ 0.25μmol、Tween200.025μL、MgSO₄0.2-20μmol、甜菜碱20μmol、钙黄绿素0.00125μmol、MnCl₂0.015μmol、4种脱氧核苷酸各0.035μmol、Bst DNA聚合酶8U，所述内侧引物对的上游引物和下游引物各0.04-0.06μmol，所述外侧引物对的上游引物和下游引物各0.004-0.008μmol，所述环形引物对的上游引物和下游引物各0.02-0.04μmol；

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：每23μL所述环介导等温扩增反应液中，所述MgSO₄为0.2μmol，所述内侧引物对的上游引物和下游引物为0.04μmol，所述外侧引物对的上游引物和下游引物为0.004μmol，所述环形引物对的上游引物和下游引物为0.02μmol。

7.一种检测死亡动物中是否携带猪肺炎支原体的方法，包括如下步骤：用权利要求1所述的专用引物或权利要求2至6中任一所述试剂盒对来自死亡动物的总DNA进行环介导等温扩增反应，检测扩增产物，确定死亡动物中是否携带猪肺炎支原体；所述环介导等温扩增反应的条件为：60-65℃、20-90分钟。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述检测死亡动物中是否携带猪肺炎支原体的方法中还包括将进行完所述环介导等温扩增反应的样本80-90℃反应2-10分钟的步骤。

9.权利要求1所述专用引物在制备猪肺炎支原体检测试剂盒中的应用。