[发明专利]一种猪肺炎支原体检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪肺炎支原体检测试剂盒及其应用。

背景技术

猪支原体肺炎是由猪肺炎支原体引起的猪的一种高发病率、低死亡率的慢性呼吸道传染病，在我国常被称为猪气喘病(或喘气病)。猪支原体肺炎广泛分布于世界各地，猪群中的感染率在30％-80％，目前大多数养猪国家均报道有此病的发生。发病后可出现慢性干咳，长期生长发育不良，生长率和饲料转化率降低，一般死亡率不高，但继发性感染也会造成严重死亡，所致的经济损失很大，对养猪业发展带来严重危害，所以该病是最常发生和经济意义重大的猪病之一。

猪肺炎支原体的现有检测方法大致可以分为两大类，一是传统病原分离培养法，二是分子生物学方法。由于猪肺炎支原体是最难分离和鉴定的病原体之一，生长缓慢，耗时较长，且经常因猪鼻支原体过度生长而被掩盖，而且药物治疗后或康复的猪也很难再分离出猪肺炎支原体，因此病原分离培养在临床检测中并不被经常使用；分子生物学方法主要包括聚合酶链式反应(PCR)和核酸探针检测。PCR检测又包括常规PCR，随机引物PCR，nested PCR，RealTime PCR等方法。PCR方法快速、灵敏，但需要使用特殊的仪器，如PCR仪，而荧光探针的制备比较昂贵，不适于基层应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于环介导等温扩增(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP)技术的快速检测猪肺炎支原体的试剂盒。

本发明提供了检测猪肺炎支原体的专用引物，由以下三对环介导等温扩增所用引物组成：一对引物是与猪肺炎支原体GenBank Accession Number NC-006360中16S ribosomal RNA基因结合的内侧引物对，一对引物是与猪肺炎支原体GenBankAccession Number NC-006360中16S ribosomal RNA基因结合的外侧引物对，一对引物是与猪肺炎支原体GenBank Accession Number NC-006360中16S ribosomal RNA基因结合的环形引物对。

具体来说，所述专用引物中，一对引物可为能结合于猪肺炎支原体基因组GenBank Accession Number NC-006360中自5′末端第876699至876919位核苷酸区域(16S ribosomal RNA基因部分序列)的内侧引物对，一对引物可为能结合于猪肺炎支原体基因组GenBank Accession Number NC-006360中自5′末端第876699至876919位核苷酸区域(16S ribosomal RNA基因部分序列)的外侧引物对，一对引物可为能结合于猪肺炎支原体基因组GenBank Accession Number NC-006360中自5′末端第876699至876919位核苷酸区域(16S ribosomal RNA基因部分序列)的环形引物对。

更具体来说，所述内侧引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列可为序列表中的序列4，下游引物的核苷酸序列可为序列表中的序列5；所述外侧引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列可为序列表中的序列2，下游引物的核苷酸序列可为序列表中的序列3；所述环形引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列可为序列表中的序列6，下游引物的核苷酸序列可为序列表中的序列7。

本发明所提供的猪肺炎支原体检测试剂盒是含有所述专用引物的试剂盒。

该猪肺炎支原体检测试剂盒在使用过程中，所述的内侧引物对、外侧引物对和环形引物对作为一个整体组使用，使用时应该尽量避免引物二聚体的形成。

所述内侧引物对包括上游引物(FIP)和下游引物(BIP)，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列4，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列5；所述外侧引物对包括上游引物(F3)和下游引物(B3)，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列2，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列3；所述环形引物对包括上游引物(LF)和下游引物(LB)，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列6，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列7。

所述试剂盒还可包括环介导等温扩增试剂和检样管。

所述检样管为含FTA卡片的离心管。

所述试剂盒和可包括阳性对照和阴性对照。

所述阳性对照可为FTA卡片上黏附了如下核酸序列或粘附了含有如下核酸序列的质粒的检样管：