[发明专利]一种乙肝病毒双表达质粒及构建方法和应用

权利要求书

1.一种乙肝病毒双表达质粒，其特征在于，其包括真核细胞表达载体VR1012上插入核苷酸序列的乙肝病毒前C-C基因和自身复制调控元件增强子II以及含调控序列的乙肝病毒前S-S基因和自身复制调控元件增强子I。

2.一种乙肝病毒双表达质粒的构建方法，其步骤如下：首先以血清中的HBV DNA为模板，用套式PCR分别扩增出乙肝病毒增强子II/前C-C基因或增强子I/前S-S基因，然后通过基因克隆连入真核表达载体VR1012，克隆筛选得到单表达质粒VEC和VES；采用单引物二次PCR法突变VES，在调控表达单元下游插入酶切位点，PCR扩增VEC中完整的调控和表达单元并克隆到突变后的VES中，克隆筛选得到利用各自的启动子分别表达前C-C和前S-S的双表达质粒。

3.根据权利要求2所述的乙肝病毒双表达质粒的构建方法，其特征在于：所述的单引物二次PCR法为点突变，第一轮PCR，加入正向单引物扩增，得到少量变异链；第二轮PCR，加入反向单引物，反向单引物序列与正向变异链互补。

4.根据权利要求2或3所述的乙肝病毒双表达质粒的构建方法，其特征在于：所述的单引物二次PCR法突变VES，首先合成1对引入插入突变的引物，插入NheI、Pac I、Fse I和Age I酶切位点，VR-正向和VR-反向；进行第一轮PCR：以VES质粒为模板，加入正向引物VR-正向，PCR扩增；再进行第二轮PCR：以第一轮PCR反应产物为模板，加入反向引物VR-反向，PCR扩增；然后对PCR产物进行选择性酶切，转化细菌后克隆筛选得到突变VES基因。

5.根据权利要求2所述的乙肝病毒双表达质粒的构建方法，其特征在于：所述的PCR扩增VEC，以含Nhe I酶切位点的VR2012-PF为正向引物、含Age I酶切位点的VR2012-PR为反向引物。

6.一种乙肝病毒双表达质粒的构建方法，其步骤如下：首先以血清中的HBV DNA为模板，用套式PCR分别扩增出乙肝病毒增强子II/前C-C基因和增强子I/前S-S基因，然后通过基因克隆连入真核表达载体VR1012，克隆筛选得到单表达质粒VEC和VES；采用单引物二次PCR法突变VEC，在调控表达单元下游插入酶切位点，PCR扩增VES中完整的调控和表达单元并克隆到突变后的VEC中，克隆筛选得到利用各自的启动子分别表达前C-C和前S-S的双表达质粒。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的乙肝病毒双表达质粒在预防和治疗乙型肝炎基因疫苗中的应用。