[发明专利]一种乙肝病毒双表达质粒及构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种乙肝病毒双表达质粒疫苗及构建方法和应用，具体是一种乙肝病毒前C-C(preC-C)基因和前S-S(preS-S)基因双表达质粒及构建方法和应用，属于HBV DNA疫苗的设计制造及免疫效果检测的生物学领域。

背景技术

慢性乙型肝炎严重危害人类健康，目前尚无特效治疗手段。乙肝病毒(HBV)感染人体后发生慢性化的主要原因是被感染者缺乏有效的特异性细胞免疫应答，不能清除体内病毒。由于DNA疫苗在诱导机体特异性细胞免疫方面具有独特优势，已作为针对慢性乙肝具有潜力的免疫治疗手段被广泛研究。目前乙肝DNA疫苗研究的焦点在于如何诱导足够强的特异性细胞免疫，以达到抑制或消灭病毒、治疗乙肝的目的。

选择合适的目的基因和载体体外连接构建重组质粒，是研究治疗型HBV DNA疫苗的关键基础步骤。对所选目的基因的要求是：能够诱导机体产生较强的针对HBV抗原的特异性细胞免疫反应。HBV的基因组是一环状的部分双螺旋结构，长约3.2kb。基因组中已确定的开放读框有4个，分别编码病毒的核壳(C)和包膜(S)蛋白，病毒DNA聚合酶及X蛋白。目前学者们公认，S基因和C基因是HBV DNA疫苗常用的备选基因，它们都具有强免疫原性，但以往的疫苗都选用单一基因。

因此，提供一种乙肝病毒双表达质粒基因疫苗就成为该技术领域急需要解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种乙肝病毒双表达质粒基因疫苗，具体的说是以乙肝病毒前C-C基因、前S-S基因和自身复制调控元件增强子为目的基因构建的重组HBV DNA双表达质粒(VCS)。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种乙肝病毒双表达质粒，其特征在于，其包括真核细胞表达载体VR1012上插入核苷酸序列的乙肝病毒前C-C基因和自身复制调控元件增强子II，以及含调控序列的乙肝病毒前S-S基因和自身复制调控元件增强子I。

本发明的目的之二在于提供一种上述乙肝病毒双表达质粒的构建方法。

本发明的上述目的是通过以下两种技术方案实现的：

一种乙肝病毒双表达质粒的构建方法，其步骤如下：首先以血清中的HBV DNA为模板，用套式PCR分别扩增出乙肝病毒增强子II/前C-C基因和增强子I/前S-S基因，然后通过基因克隆连入真核表达载体VR1012，克隆筛选得到单表达质粒VEC和VES；采用单引物二次PCR法突变VES，在调控表达单元下游插入酶切位点，PCR扩增VEC中完整的调控和表达单元并克隆到突变后的VES中，克隆筛选得到利用各自的启动子分别表达前C-C和前S-S的双表达质粒。

一种优选技术方案，其特征在于：所述的单引物二次PCR法为点突变的单引物二次PCR法，是改良的实现环状质粒点突变的方法，该方法的特征为：将PCR分为两步，先加入正向单引物扩增，引物只能与一条反向模板链结合，生成正向的环状变异互补链，退火后，引物仍然只能与反向模板链结合，PCR扩增效率不高，但能够得到少量确切的变异链；第二轮PCR中，加入反向单引物，此引物可能与正向变异链结合，也可能与正向原模板链、正向引物结合，但由于引物序列与正向变异链完全互补，正向引物又在第一轮PCR中消耗一部分，故引物与正向变异链结合机率较高；然后对PCR产物进行选择性酶切，转化细菌后克隆筛选得到突变VES基因。

一种优选技术方案，其特征在于：所述的单引物二次PCR法突变VES包括：首先合成1对引入插入突变的引物，并插入Nhe I、Pac I、Fse I和Age I酶切位点，VR-正向和VR-反向；进行第一轮PCR：以VES质粒为模板，加入正向引物VR-正向，PCR扩增；再进行第二轮PCR：以第一轮PCR反应产物为模板，加入反向引物VR-反向，PCR扩增；然后对PCR产物进行选择性酶切，转化细菌后克隆筛选得到突变VES基因。

一种优选技术方案，其特征在于：所述的PCR扩增VEC，为含Nhe I酶切位点的VR2012-PF为正向引物、含Age I酶切位点的VR2012-PR为反向引物。

一种乙肝病毒双表达质粒的构建方法，其步骤如下：首先以血清中的HBV DNA为模板，用套式PCR分别扩增出乙肝病毒增强子II/前C-C基因和增强子I/前S-S基因，然后通过基因克隆连入真核表达载体VR1012，克隆筛选得到单表达质粒VEC和VES；采用单引物二次PCR法突变VEC，在调控表达单元下游插入酶切位点，PCR扩增VES中完整的调控和表达单元并克隆到突变后的VEC中，克隆筛选得到利用各自的启动子分别表达前C-C和前S-S的双表达质粒。