[发明专利]一种微通道式快速生物微粒计数方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种微通道式快速生物微粒计数方法，属于生物分析领域。

背景技术

生物微粒计数是细胞生物学，微生物学，分子生物学以及毒理学等研究领域极其重要的和必不可少的微粒“量”的统计和表征方法。常规的微粒计数方法是使用细胞计数器和显微镜。其基本方法是：制备细胞悬液，滴在计数板(特制厚玻片，其上有计数池，池底有直线条将计数池分成许多小方格)上，盖上盖玻片，然后在显微镜下用肉眼直接计数若干小方格(已知体积)内的一种或多种细胞，这样就可估算单位体积细胞悬液内这些细胞的数量或数量比。为了估算准确，需计数不少于100个细胞为止。计算计数板四大格内的细胞总数，再对格内细胞压线进行统计处理，如压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：细胞数/ml＝(4×大格细胞总数/4)×10000。这种计数方法需要繁琐的计数前准备工作和小心翼翼的手工计数，人为误差很大，工作效率低。目前的商品化的自动细胞计数器主要是用于血液分析的血细胞计数装置，其原理是将细胞溶液悬浮于含电解质的溶液中。在电压作用下，悬浮细胞颗粒在电场中会随机通过溶液池内特定小孔，并引起小孔检测处的电阻或光散射变化。通过测量小孔处的电阻或光散射变化，进行溶液池内的细胞计数。该方法不适合细胞浓度较低时的计数，且商用仪器价格较贵。现代的细胞定量分析检测手段有70年代出现的流式细胞仪。它集电子、计算机、激光、流体技术为一体，是当今功能最强，最先进的细胞定量分析仪。全球约有6家仪器生产厂商。流式细胞仪可高速分析上万个细胞，并具有强大的分析功能，可同时从一个细胞中测得多个参数，目前已有约20～30种应用功能的报道，其中也包括细胞计数检测。流式细胞仪用于生物微粒计数是目前劳动强度最小，速度最快的方法，但也是仪器成本和实验成本以及技术要求最高的方法，其仪器购买和使用非专业从事生物学研究的科研和医疗单位所能够负担。因此，针对生物微粒的常规检测-细胞计数，有必要发展简单，廉价，准确，实用的分析方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种微通道式快速生物微粒计数方法，以解决当前生物微粒计数方法存在人为误差大，工作效率低或成本高等问题

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

1)将磷酸盐缓冲液清洗后的待测生物微粒中加入固定液固定处理1小时以上，再用磷酸盐缓冲液清洗生物微粒两次以上，除去剩余的固定液，得到固定化的生物微粒。通过对固定化后的生物微粒进行超声处理5秒～10秒，可破坏生物微粒聚集现象。

固定液为质量百分比为10％以上甲醛或质量百分比为4％以上多聚甲醛；生物微粒体积与固定液的体积比为1∶10～1∶20。

2)将固定化后的生物微粒用磷酸盐缓冲液稀释到10³～10⁵(个/ml)的浓度范围内，将稀释后的生物微粒溶液以0.1～10μL/min的恒定流速通过微通道管路，生物微粒逐个通过紫外检测器后，在检测波长200～300nm下记录一定时间内检测的吸收峰数。

3)将上步数据代入公式C_生物微粒＝N/(S×T)，求得生物微粒溶液的浓度；其中T为记录时间，N为T时间内所记录的峰数，S为生物微粒溶液在通道内的流速。

通过微通道管的生物微粒还可选用非接触电导等电化学检测器，记录电导检测的峰数。

通过微通道管的生物微粒还可选用荧光检测器，在生物微粒固定之前对其先进行荧光标记，记录荧光检测器所检测到的峰数。

本发明的有益效果是

生物微粒计数方法简单，快速。根据生物微粒特性进行光学或电化学检测，可逐一进行生物微粒检测，可准确计算生物微粒浓度和生物微粒数。使传统的生物微粒计数人工观察判断获得量值标准，实现了定量分析。

附图说明

图1为微流量注射泵驱动的生物微粒计数示意图。

具体实施方式

将磷酸盐缓冲液清洗后的Hela(约10⁶个/瓶Hela细胞)细胞悬浮于200μL的质量百分比为10％甲醛溶液中进行4小时的固定化处理。完成固定化处理后用磷酸盐缓冲液将细胞清洗2遍，除去多余的甲醛。将上述固定化后的Hela细胞用50mM磷酸盐缓冲液稀释，稀释比例按照1体积细胞量加入20倍体积的溶液进行，将稀释后的吸入微流量注射泵后，在注射泵的推动下，将细胞推入毛细管通道，并使其逐个经过紫外检测器，在214nm检测波长下检测。当注射泵的推动流速为0.20μL/min时，在17分钟内检测到细胞峰数120个，所计算浓度为3×10⁴个/ml。当流速为0.14μl/ml注射泵的推动下，24分钟内检测到细胞峰数100个，所计算的浓度为3×10⁴个/ml。