[发明专利]重组肠病毒71型病毒样颗粒的制备方法

说明书

技术领域

本发明一般涉及人肠道病毒EV71型病毒样颗粒(VLP)的制备方法。更具体地，本发明涉及密码子优化后的编码肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)P1及3CD蛋白质的合成多核苷酸，以及使用优化后的合成多核苷酸制备肠道病毒71型病毒样颗粒的方法。本发明还涉及含有上述多核苷酸的重组载体和宿主。

背景技术

手足口病(Hand foot mouth disease，HFMD)是婴幼儿常见的传染病，由人肠道病毒属的柯萨奇病毒(Coxsackie virus)A组16、4、5、7、9、10型，B组2、5型；埃可病毒(ECHO viruses)和肠道病毒71型(EV 71)感染引起，其中以EV 71及Cox A16型最为常见^[1-6]。EV71感染引起的手足口病大部分病例病情较轻，可治愈，但少数患者可出现心肌炎、无菌性脑膜炎和肺水肿等并发症，严重时可危及生命^[7-11]。截止2008年5月9日止，全国感染手足口病近215万例，造成34名患儿死亡，因此，研制EV71预防性疫苗对于控制婴幼儿手足口病的流行具有重要意义。

肠道病毒71型(EV71)属小RNA病毒，病毒基因组为约7kb的单链RNA，病毒颗粒直径约为20-30nm，由VP1、VP2、VP3、VP4四种结构蛋白组成。研究显示，EV71四种结构蛋白可自我组装形成病毒样颗粒结构(Virus-Like Particle，VLP)，具有与天然病毒颗粒相似的空间结构。EV71VLP免疫小鼠可产生具有保护效力的中和抗体，可显著提高攻毒试验中实验动物的存活率^[12]，是很有前景的预防婴幼儿手足口病候选疫苗。

发明内容

本发明的一个目的是提供肠道病毒71型(EV71)病毒样颗粒(Virus-Like Particle，VLP)制备方法，该方法包括：

(1)优化肠道病毒71病毒样颗粒P1基因及3CD基因序列；

(2)将优化的肠道病毒71病毒样颗粒P1基因及3CD基因序列克隆到质粒中；

(3)用得到的质粒转化酵母细胞；

(4)从裂解的宿主细胞中分离重组肠道病毒71病毒样颗粒。

根据本发明方法的一个优选实施方案，本发明的方法中所述的酵母细胞选自：酿酒酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母、胞壁克鲁维氏酵母、乳克鲁维氏酵母或粟酒裂殖糖酵母。

本发明的方法中所述的酵母细胞优选为酿酒酵母。

根据本发明方法的一个优选实施方案，本发明的方法中所述的优化是指在不改变EV71 P1及3CD氨基酸序列的前提下，将P1及3CD基因序列的密码子替换为酵母细胞偏好(高频使用)的密码子，酵母偏好(高频使用)的密码子表见表1。本发明的方法中所述的优化还可以包括所述序列的其他改造以适合在酵母细胞中表达，例如突变不需要的酶切位点及影响或终止蛋白表达的位点。本发明中使用的术语偏好的密码子具有本领域公知的含义，也称为密码子的偏好性(CodonPreference)，是指某些生物体更偏爱使用某些同义三联密码子(即编码相同氨基酸的密码子)。

表1酵母中偏好(高频使用)的密码子表：

TTT F 0.59  TCT S 0.26  TAT Y 0.56  TGT C 0.63

TTC F 0.41  TCC S 0.16  TAC Y 0.44  TGC C 0.37

TTA L 0.28  TCA S 0.21  TAA X 0.47  TGA X 0.31

TTG L 0.28  TCG S 0.10  TAG X 0.22  TGG W 1.00

CTT L 0.13  CCT P 0.31  CAT H 0.64  CGT R 0.15

CTC L 0.06  CCC P 0.15  CAC H 0.36  CGC R 0.06

CTA L 0.14  CCA P 0.42  CAA Q 0.69  CGA R 0.07

CTG L 0.11  CCG P 0.12  CAG Q 0.31  CGG R 0.04

ATT I 0.47  ACT T 0.35  AAT N 0.59  AGT S 0.16

ATC I 0.26  ACC T 0.21  AAC N 0.41  AGC S 0.11

ATA I 0.27  ACA T 0.30  AAA K 0.58  AGA R 0.48