[发明专利]一种HIV-1融合抑制剂体外筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说是涉及一种HIV-1融合抑制剂体外 筛选方法。

背景技术

目前HIV-1融合抑制剂体外筛选方法主要有以下两大类：

1、基于gp41N-螺旋与C-螺旋相互作用的筛选方法

位于HIV-1包膜表面的跨膜蛋白gp41是三聚体蛋白，gp41的三段C-螺 旋以反向平行的方式堆积在N-螺旋三聚体表面的疏水凹槽，形成稳定的六螺 旋束结构，将病毒包膜与宿主细胞膜拉近，导致膜融合的发生。抑制gp41N- 螺旋与C-螺旋相互作用的化合物会抑制六螺旋束结构的形成，从而抑制膜融 合的发生。基于gp41N-螺旋和C-螺旋相互作用的筛选方法主要存在靶位不单 一、标记物影响N-螺旋/C-螺旋构象、检测时间长等缺点。

2、基于gp41五螺旋蛋白与C-螺旋相互作用的筛选方法

Root等人(Root MJ，Kay MS，Kim PS.Protein design of an HIV-1-1 entry inhibitor.Science，2001，291(5505)：884-888.)报道了根据蛋白质工程原理设计 的由3个N-螺旋与2个C-螺旋交错相连而成的五螺旋蛋白。五螺旋蛋白可通 过其表面暴露出来的疏水凹槽与C-螺旋结合形成稳定的六螺旋束结构，与五 螺旋蛋白表面疏水凹槽结合的化合物可抑制五螺旋蛋白与C-螺旋的结合，具 有潜在的抗HIV-1融合活性。五螺旋蛋白可以通过基因工程的手段大量获得， 其成本大大低于化学合成方法。Frey等人(Frey G，Rits-Volloch，S，Zhang，XQ， et al.Small molecules that bind the inner core of gp41 and inhibit HIV-1 envelope-mediated fusion.Proceedings of the National Academy of Sciences，U.S. A.，2006，103(38)：13938-13943.)报道了基于五螺旋蛋白与荧光素标记C-螺旋 的相互作用而建立的极化荧光融合抑制剂筛选方法，即将五螺旋蛋白与待测 化合物样品在室温孵育1小时后加入荧光素标记的C-螺旋，继续室温孵育1.5 小时，用高通量药物筛选分析仪测定荧光极化指标，计算待测化合物样品的 抑制率。这种方法的缺点是对五螺旋蛋白的纯度要求较高、检测时间较长、 所需检测仪器昂贵。

发明内容

本发明的目的是提供一种步骤简单、快速便捷且成本低廉的HIV-1融合 抑制剂体外筛选方法。

本发明所提供的一种HIV-1融合抑制剂体外筛选方法，包括以下步骤：

(1)HIV-1gp41五螺旋蛋白的包被

将可吸附组氨酸标签的磁珠与带有组氨酸标签的HIV-1gp41五螺旋蛋白 粗提物于微孔板上在20-40℃下孵育10-20分钟，于磁板上沉淀后甩去孔中液 体，洗板后待用；

(2)待测化合物样品的制备

室温下将待测化合物样品用二甲亚砜配制成不同浓度的溶液，充分振荡 溶解后备用；

(3)待测化合物样品的筛选

微孔板设阴性对照3孔，每孔分别加入2μl二甲亚砜，设阳性对照3孔， 包被时不加五螺旋蛋白粗提物，其他孔中每孔分别加入2μl不同浓度的待测化 合物样品，之后所有孔均分别加入98μl报告基团标记C-螺旋溶液，振荡器充 分混匀后，在15-40℃下孵育10分钟，甩去孔内液体，洗板后用荧光分析仪 检测报告基团信号，计算待测样品的抑制率。

按照以下公式计算待测样品的抑制率：

本发明方法具有以下有益效果：

本发明用可吸附组氨酸标签的磁珠对带有组氨酸标签的HIV-1gp41五螺 旋蛋白粗提物于微孔板上进行选择性包被，将原本独立进行的五螺旋蛋白纯 化与融合抑制剂筛选两个过程有机地整合起来，以达到简化步骤、缩短时间、 降低成本的目的。现有方法中五螺旋蛋白纯化与融合抑制剂筛选共需20小时 左右，而本发明方法可将这两个过程缩短至1小时以内，同时大大降低了筛 选成本。

附图说明

图1是HIV-1融合抑制剂N-(4-羧基-3-羟基)苯-2，5-二甲基吡咯的抑制曲 线(样品孵育温度15℃)；