[发明专利]一种筛选疾病标志物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种筛选疾病标志物的方法。

背景技术

疾病的发生、发展均导致细胞中相关分子的种类和数量发生变化，这些与特定疾病密切相关的分子就是疾病标志物。发现和寻找疾病标志物，并从分子水平检测和跟踪这些变化是理解疾病发生机理、提高诊断准确性、提早诊断窗口期、制定合理治疗方案以及监测治疗效果的一个非常有效途径。目前用于寻找疾病标志物的方法一般是质谱与二维电泳联用的蛋白质组学方法。但是该方法在膜蛋白的鉴别方面有很大的局限性，主要因为膜蛋白的溶解性差。所有的蛋白中大约有30％是膜蛋白，目前只有不到5％膜蛋白可通过二维电泳质谱联用技术鉴别出来(Wu，C.C.；Yates，J.R.III.The application of mass spectrometry to membrane proteomics.Nat.Biotechnol.2003，21，(3)，262-7)。膜蛋白是在细胞信号传导和与外界物质交换中起关键性作用的分子，很多疾病的发生、发展都会引起膜蛋白的变异，导致膜蛋白的种类和数量发生变化，而这些变化的膜蛋白就是潜在的疾病标志物分子。另外对于非蛋白类细胞膜表面的疾病标志物分子，上述的蛋白质组学的方法也是无能为力的。如何有效的发现这些标志物分子依然是目前分子细胞生物学研究的一个重大挑战。

发明内容

本发明的目的是提供一种筛选疾病标志物的方法。

本发明所提供的筛选疾病标志物的方法，包括如下步骤：

(a)用离体的靶疾病细胞对核酸文库进行筛选，得到与靶疾病相关的核酸适体；所述核酸文库为单链的随机核苷酸序列的文库；

(b)将所述与靶疾病相关的核酸适体与所述离体的靶疾病细胞上的靶分子结合，得到所述核酸适体和所述靶分子的复合物，再分离所述复合物，得到所述靶疾病细胞上的靶分子，即为靶疾病标志物。

其中，在所述步骤(a)后、步骤(b)前，还可包括将所述核酸适体标记的步骤。这样得到标记的与靶疾病相关的核酸适体，在步骤(b)中用标记的与靶疾病相关的核酸适体与所述离体的靶疾病细胞上的靶分子结合；标记利于后续靶分子的分离与检测。

所述将核酸适体标记具体可以将核酸适体标记上信号分子(如罗丹明B、荧光素)、活性分子(如生物素、氨基、羧基)。

所述核酸文库具体可为单链DNA文库、单链RNA文库、或修饰的单链核酸文库。所述随机核苷酸序列的长度可为25-60个碱基，优选为52个碱基。

所述核酸文库具体可以为如下的文库：两端为15-25个碱基的固定核苷酸序列，中间为25-60个碱基的随机核苷酸序列，如5’-ATA CCA GCT TAT TCA ATT-52-nt-AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3’。其中，两端固定序列可以用于设计引物，以便于扩增筛选出的文库。

所述步骤(a)中筛选的方法包括如下步骤：

(1)以所述核酸文库为起始核酸文库；

(2)将所述起始核酸文库的溶液与所述离体的靶疾病细胞孵育，得到所述靶疾病细胞与起始核酸文库中部分核酸分子的复合体，分离复合体，得到与所述离体的靶疾病细胞结合的核酸文库；

(3)将所述与所述离体的靶疾病细胞结合的核酸文库的溶液与离体的非靶疾病细胞孵育，分离去除与所述离体的非靶疾病细胞结合的核酸分子，剩余没有与所述非靶疾病细胞结合的核酸分子；

(4)得到与靶疾病相关的核酸适体。

其中，所述步骤(2)中，在所述得到与所述离体的靶疾病细胞结合的核酸文库后，还可包括如下步骤：PCR扩增所述与离体的靶疾病细胞结合的核酸文库，并制备成单链。

所述步骤(3)中，在所述剩余没有与所述非靶疾病细胞结合的核酸分子后，还可包括如下步骤：PCR扩增所述没有与所述非靶疾病细胞结合的核酸分子，并制备成单链。

所述步骤(a)中筛选的方法中，在所述步骤(3)之后、步骤(4)之前，还可包括至少1次以下操作：以所述没有与所述非靶疾病细胞结合的核酸分子为起始核酸文库，重复步骤(2)和(3)，每次操作均以前一次操作中得到的没有与所述非靶疾病细胞结合的核酸分子为起始核酸文库。

所述步骤(a)中，在所述得到与靶疾病相关的核酸适体后、所述将所述核酸适体标记前，还可包括对所述核酸适体进行修饰的步骤；所述修饰的方法为对所述核酸适体进行剪切、对所述核酸适体中的核苷酸单元进行替换、对所述核酸适体中的碱基、核糖或磷酸骨架进行修饰。