[发明专利]特异检测蛋白质或多肽半胱氨酸巯基修饰的方法及其用途

权利要求书

1.一种特异检测蛋白质或多肽半胱氨酸巯基相关修饰的方法，包括下列步骤：

1)使用自由巯基特异性封闭试剂封闭所述蛋白质或多肽上的自由巯基；

2)除掉未结合的封闭试剂，使用所述半胱氨酸巯基相关修饰的特异性还原剂将被修饰的半胱氨酸巯基还原为自由巯基，同时加入巯基特异性不可逆的标记试剂将被还原的自由巯基标记为带有标签的巯基；

3)除去未结合的标记试剂后，加入二硫键还原试剂，还原蛋白质或多肽分子间的二硫键；和

4)亲和纯化具有带有所述标签的巯基的蛋白质或多肽，使用亲和素变性的方法来洗脱所述蛋白质或多肽，并随后对洗脱的蛋白质或多肽进行蛋白质或多肽印迹或者质谱鉴定。

2.按照权利要求1的方法，其中所述二硫键还原试剂选自二巯基苏糖醇(dithioerythritol，DTT)、2-巯基乙醇(2-ME，2-mercaptoethanol)、磷酸三丁酯(TBP，tributyl phosphate)、或磷酸三(2-氯乙)酯(TCEP，tris(2-chloroethyl)phosphate)。

3.按照权利要求1的方法，其中所述巯基特异性不可逆的标记试剂包括三个部分：

一个巯基特异的巯基反应基团；

一个可以被特异识别纯化的标签分子(tag)；和

一个连接这两部分的连接体(linker)，

其中所述巯基反应基团选自马来酰亚胺、N-乙基马来酰亚胺或碘乙酰胺中的巯基反应基团，所述可以被特异识别纯化的标签分子选自生物素(biotin)、生物胞素(biocytin)、脱硫生物素(desthiobiotin)，或被特异识别纯化的小肽段，所述小肽段包括His₆(6个组氨酸，six histidine residues)，所述连接体是一个或多个，选自稳定同位素或遇光断开的连接基团。

4.按照权利要求1的方法，其中所述巯基特异性不可逆的标记试剂选自生物素马来酰亚胺(biotin-M，biotin-maleimide)、生物素聚乙二醇马来酰亚胺(biotin-PEO-M，biotin-PEO-maleimide)、3-(马来酰亚胺丙酰)-生物胞素(3-(N-maleimidopropionyl)-biocytin)、N-碘乙酰-N-生物素己二胺(N-iodoacetyl-N-biotinylhexylenediamine，Iodoacetyl-LC-Biotin)、碘乙酰聚乙二醇生物素(Iodoacetyl-PEG2-Biotin)、1-生物素胺-4-(4’-[马来酰亚胺乙基-环己烷]-甲酰胺)丁烷(1-Biotinamido-4-(4′-[maleimidoethyl-cyclohexane]-carboxamido)butane)、或轻或重同位素亲和标签试剂(ICAT reagents light orheavy)。

5.用于特异检验蛋白质或多肽半胱氨酸巯基相关修饰的试剂盒，包括巯基特异性不可逆的标记试剂和二硫键还原试剂。

6.按照权利要求5的试剂盒，还包括自由巯基特异性封闭试剂、所述半胱氨酸巯基相关修饰的特异性还原剂、亲和纯化缓冲液、亲和纯化介质或变性洗脱剂。

7.按照权利要求5或6的试剂盒用于筛选新的生理相关的内源靶点或者外源半胱氨酸巯基相关修饰的蛋白质或多肽靶点的用途。

8.按照权利要求5或6的试剂盒用于筛选和设计可以调节蛋白质或多肽半胱氨酸巯基相关修饰的药物中的用途。

9.按照权利要求5或6的试剂盒在检测样品中半胱氨酸巯基相关修饰含量的用途。

10.按照权利要求5或6的试剂盒在利用蛋白质组学技术来研究或者筛选半胱氨酸巯基相关修饰的蛋白质中的用途。