[发明专利]特异检测蛋白质或多肽半胱氨酸巯基修饰的方法及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质或多肽翻译后修饰的检测领域，具体地，涉及蛋白质或多肽半胱氨酸巯基相关修饰的检测领域，更具体地，涉及检测蛋白质或多肽半胱氨酸巯基相关修饰的方法及其用途，以及执行该方法的试剂盒。

背景技术

蛋白质或多肽上的半胱氨酸(cysteine，cys)含有一个自由巯基(-SH)。这个巯基可以发生各种蛋白质翻译后修饰。每种修饰都有特殊的调节方式和生物学作用。随着蛋白质组学的发展，可以大通量筛选具有这些修饰的蛋白质靶点的方法逐渐被发展出来。而实际上，其中几种修饰可以用同一种原理来检测。它们的原理都是基于“生物素转换”后再纯化的方法(biotinswitch assay)。对于一种单一修饰而言，将样品中具有这种修饰的半胱氨酸都特异的转换为带有特异标签的半胱氨酸，之后纯化并鉴定这些有标签的蛋白或多肽，就可以确定原始样品中哪些蛋白质靶点或者半胱氨酸位点发生了修饰。

具体步骤简要介绍为：第一步，封闭原始样品中蛋白质上的所有自由半胱氨酸的巯基，因为自由巯基会干扰最后的标签标记反应；第二步，去除过量封闭试剂后，使用对某一种修饰特异的还原试剂将被修饰的半胱氨酸还原为自由半胱氨酸，同时加入自由巯基特异的标记试剂，标记试剂上具有标签(比如，生物素(biotin))，它们可以特异的标记这些还原出来的自由半胱氨酸，也就是说：标记上生物素的蛋白或多肽就是原始样品中存在修饰的蛋白或多肽；第三步，使用生物素特异的纯化试剂来纯化生物素化的蛋白或多肽并洗脱下纯化的蛋白或多肽；最后得到的纯化下来的蛋白或多肽可以使用蛋白质印迹或者质谱方法来鉴定。

这类方法的比较早的应用是在蛋白质巯基亚硝基化的检测上^1-3。之后被应用到蛋白质巯基次磺酸化⁴和蛋白质巯基棕榈酰化^5，6中。下面以蛋白质巯基亚硝基化为例子介绍具体的研究方法。

蛋白质巯基亚硝基化(nitrosation，S-nitrosylation)是一种一氧化氮(nitricoxide，NO)相关的基于蛋白质自由半胱氨酸(cysteine，cys)的蛋白质翻译后修饰：蛋白质自由半胱氨酸上的自由巯基(Cys-SH)被一氧化氮或其衍生物转换为亚硝基化的巯基(Cys-SNO)。这种修饰被认为是一氧化氮信号转导的一种重要机制，广泛参与各种生理和病理过程⁷。很多蛋白质巯基亚硝基化靶点都是利用一种名叫“生物素转换方法”(biotin switch assay)研究和鉴定的^2，3。原始的生物素转换方法可以检测蛋白质巯基亚硝基化，具体的实验步骤可以简略的介绍为：第一步，自由巯基使用巯基特异的封闭试剂MMTS(methyl methanethiosulfonate，甲基硫代磺酸甲酯)封闭；第二步，使用丙酮沉淀去除多余的MMTS封闭试剂；第三步，蛋白质上的亚硝基化半胱氨酸Cys-SNO使用特异的还原剂ascorbate(抗坏血酸钠)还原为自由巯基，之后使用含有混合二硫键的可逆的生物素化试剂biotin-HPDP(N-[6-(biotinamido)hexyl]-3’-(2’-pyridyldithio)propionamide，N-(6-[生物素胺]己基)-3，-(2，-吡啶二硫)丙酰胺)标记这些自由巯基。最后生物素化的蛋白使用链亲和素琼脂糖凝胶珠子(streptavidin-agarose)纯化并使用二硫键还原试剂洗脱，比如2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol，2-ME)。洗脱下来的蛋白就是发生了巯基亚硝基化的蛋白，这些蛋白可以使用蛋白印迹或者质谱检测来鉴定。

原始方法已经申请了美国专利(US Patent 7001738-Method for assayingprotein nitrosylation)和国际专利((WO/2002/039119)METHOD FORASSAYING PROTEIN NITROSYLATION)。简要内容包括：

第一：建立了一种分析蛋白质亚硝基化的方法。对于包含至少一种蛋白质的测试样品，使用一种巯基烷基化试剂来封闭蛋白上的自由巯基。蛋白上的亚硝基化巯基键被还原为自由巯基。多余的巯基烷基化试剂从样品中去除。自由巯基和一种可以检测的带标签的，活化的混合二硫键反应，将标签转移到蛋白上。蛋白上可检测的标签被检测。