[发明专利]HPV16型L2N120E7E6融合蛋白、基因、制备方法及用途

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域。具体地，本发明涉及一种人乳头瘤病毒(HPV)16型L2N120E7E6融合蛋白、其编码基因、质粒载体、表达菌株、制备方法及其免疫预防和治疗用途。

背景技术

宫颈癌是当前世界范围内造成妇女癌症死亡的主要因素之一。在发展中国家，宫颈癌则是妇女恶性肿瘤中最常见的类型，它的筛查和治疗给人们带来了巨大的经济负担。寻找有效的预防和治疗宫颈癌及其癌前病变的手段成为当务之急。大量的研究已充分证实，宫颈癌及其癌前病变的发生与人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)感染有十分密切的关系。目前超过100多种HPV被确认，其中50种与生殖道感染有关，可通过性交传播。15种被认为是高危型HPV，HPV16就是其中最常见的类型。高危型HPV的慢性、持续性感染被确认为宫颈癌及其癌前病变的主要原因。有证据表明，宿主的免疫应答，尤其是细胞免疫水平，是影响HPV相关疾病形成的主要因素。正是由于HPV相关疾病与机体对HPV的免疫反应密切关系，使得人们有可能用疫苗免疫的策略来预防和治疗HPV的感染，从而进一步达到预防和治疗宫颈癌及宫颈癌前病变的目的。HPV预防性和治疗性疫苗早在九十年代初就已经在开始研制。目前预防性疫苗已取得了重要进展，06年Merk公司的HPV预防性疫苗Gardix通过美国FDA批准进入市场。预防性疫苗的免疫策略主要集中在如何诱发出针对HPV相关表位的高滴度中和抗体和预防感染。在这方面，以HPV16衣壳蛋白L1，L2为靶抗原的病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)，在动物实验和临床试验中均表现出良好的预防HPV感染的效果。治疗性疫苗主要通过诱发机体产生针对病毒抗原的细胞免疫，从而清除病灶和被病毒感染的细胞。由于HPV16早期蛋白E6，E7是诱导和维持癌细胞恶性表型所必需的，它们就成为了治疗性疫苗理想的靶抗原。各种以它们为靶抗原的治疗性疫苗在动物实验上均表现出良好的细胞免疫。根据近期发表的临床研究资料表明人体内E6蛋白的T细胞免疫原性强于E7蛋白。在我们的早期研究中设计的靶抗原不含E6。因此在本研究中，我们在原有研究(参见相同申请人的未决申请：中国专利申请号200810227047.6)的基础上，将L2E7融合蛋白后再接上E6抗原，考虑到形成的分子太大，会影像表达水平，我们将具有载体蛋白作用的L2蛋白C端缺失只留N端120个氨基酸，以期获得的新融合蛋白的高表达，在未来的人体临床试验中，表现出强的免疫原性。并改善其水溶性。实验证明通过该设计方案得到了预期的结果，并在动物试验中观察到了它的抗肿瘤免疫效果和L2E7融合蛋白相当，E6抗原在C57小鼠上诱发的特异性T细胞免疫反应水平较低，这与其他发表的文献报道一致。

发明内容

下面详细讨论本发明各种技术方案的制备和使用，但应该理解，本发明提供了许多适用的发明构思，其可以体现在各种各样的具体方面上。

为有助于理解本发明，下面定义了一些术语。本文定义的术语具有本发明相关领域的普通技术人员通常理解的含义。术语可用于说明的具体实例的一般类别，但它们的使用不限制本发明，权利要求中所概括的除外。

除非另外指出，本文所述的“HPV”是指人乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus)；

除非另外指出，本文所述的“bp”是指碱基对(base pair)；

除非另外指出，本文所述的“ELISPOT”是指酶联免疫斑点(Enzyme-linked immunospot)；

除非另外指出，本文所述的“IPTG”是指异丙基硫代-β-D半乳糖苷(Isopropylthio-β-D-galactoside)；

除非另外指出，本文所述的“SDS-PAGE”是指十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)；

除非另外指出，本文所述的“HRP”是指辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase)；

除非另外指出，本文所述的“IFN-γ”是指γ-干扰素(Interfern gamma)；

除非另外指出，本文所述的“PBS”是指磷酸盐缓冲液(Phosphate bufferedsaline)；

本发明旨在提供一种能简单、经济、有效的制备人类乳头瘤病毒HPV16L2N120E7E6融合蛋白的优化基因核苷酸序列，该优化基因能在大肠杆菌中获得大量表达，表达蛋白能用于HPV16感染和相关宫颈癌的预防和治疗。