[发明专利]微管内等电聚焦和剪断吹出培养测定微生物等电点的方法

说明书

技术领域

本发明应用一种微管内等电聚焦和将微管等分剪断，再吹出微生 物进行培养，测定微生物等电点的方法，属于生物分析领域。

背景技术

微生物具有表面电荷和两性特性，具有等电点(pI)。微生物表面 电荷和等电点特性是由微生物细胞膜或细胞壁表面的氨基酸残基、糖 蛋白和脂类等分子的总体带电性质所决定。因此，不同微生物以及不 同生长代谢状态时的微生物均可用其表面电荷特性以及等电点特性 进行表征。研究微生物表面电荷的带电特征，可表征微生物自身的生 理生化特性，并对研究其生长代谢状态、检测和表征微生物表面的生 化反应等具有重要的理论和应用价值。已有毛细管电泳方法主要是将 微生物样品进行等点聚焦分离，以初步分离不同的微生物，通过比较 微生物样品与等电点标记物迁移时间的相对关系估算等电点。此等点 聚焦方法需要经过复杂的进样步骤，且不能直观地检测到活体微生物 和准确测定微生物等电点。目前生物学尚没有通用的确定微生物等电 点的测定方法和报道。

发明内容

本发明的目的是为了解决简单、快速、直观判断微生物等电点 范围的问题，而提供一种微管内等电聚焦和剪断吹出培养测定微生物 等电点的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明的一种微管内等电聚焦和剪断吹出培养测定微生物等电 点的方法，具体测量步骤为：

1)用0.1M盐酸对微管壁进行冲洗，去除管壁上附着的杂质；然 后将体积分数为4％的载体两性电解质和体积分数为0.1％的甲基纤 维素加入无菌水，向其中加入微生物样品，浓度为10⁵cfu/ml，构成 样品溶液，注满微管；一端插入阴极缓冲液，另一端插入阳极缓冲液， 然后加10～25KV的恒定电压进行聚焦，待电流平稳后，聚焦完成， 停止加电压，使微管内部形成连续pH梯度的两性电解质。

其中微管材料为熔融石英、光纤或高分子聚合物，内径 25～1000μm，长度20～200cm。

2)将微管取出，根据所加两性电解质形成的pH梯度与微管总长 的线性关系，对微管进行等分剪断，使每段微管指示了一定的pH范 围。

3)用无菌水将微管内溶液吹出到固体培养基上，进行细菌培养。 对细菌培养结果进行菌落观察，根据有菌落生长的微管在总管长中所 处的位置来确定微生物的pH范围，即等电点范围。

本发明的有益效果是

1)自由溶液等电聚焦操作简单，对所用微管要求不高，无需对 微管内壁进行修饰和复杂的前处理。

2)检测方法采用细菌培养的生物学方法，成熟可靠。

3)测定方法简单，快速，直观，该方法不仅可用于各种微生物 等电点测定，并可用于微生物菌种的筛选。

附图说明

图1为微管内充满溶液示意图；

图2为微管内等电聚焦完成示意图；

图3为微管等分剪断示意图；

图4为每段微管内液体吹出培养示意图。

其中1-检测窗口。

具体实施方式

实施例1

1)将熔融石英毛细管(100μm i.d.柱长52cm)用0.1M HCl冲 洗5min。

用磷酸盐缓冲液(PBS pH 7.0)将菌样制成菌悬液。使用时用PBS 溶液稀释至10⁵CFU/ml浓度，并加入4％两性电解质(Ampholine， pH范围3.5-10.0)和0.1％甲基纤维素制成细菌样品。

2)用手动泵向毛细管内注入制备好的细菌样品，使用阴极缓冲 液20mM NaOH，阳极缓冲液20mM H₃PO₄，加15kV进行聚焦。聚 焦15min后，电流趋于平稳，聚焦完成，停止加电压。

3)轻轻水平取出含细菌溶液的毛细管，将毛细管等分切断，每 4cm长为一段，52cm共切成13段，则每段对应的pH范围为0.5。 用无菌水将每段的样品液吹出至已灭菌的固体LB培养基上进行细菌 培养，同时设置空白对照。细菌培养条件为37℃恒温培养18～24h。 对培养结果进行观察。在pH范围为6.5～7一段毛细管吹出的样品， 有微生物E.coli JM83菌落生长，而其它平板及空白对照组均无菌落 生长，从而可以确定微生物E.coli JM83的等电点在pH 6.5～7之间。