[发明专利]一种植物基因组快速提取试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，通过对传统碱裂解制备基因组的方法进行优化而开发了一种适于PCR扩增的快速提取多种植物基因组的方法，以及适用于该方法的试剂盒。

背景技术

自1994年首批转基因作物如延熟西红柿和抗除草剂棉花获准商业化生产以来，国内外已经报道的商业化的转基因作物共有16类70多种[James：Brief No.21-2000：Global status of commercializedtransgenic crops.2000]。转基因作物和转基因食品因其在抗逆性或营养学价值和食物风味的改善等方面具有传统食品无可比拟的优势，而迅速占领了市场，大大满足了人们生活的需要。然而，与此同时，转基因产品的安全性也是人们一直关注的话题。包括中国在内的很多国家要求企业在产品包装中标明其中的转基因成分，以便消费者自主选择。这就要求国家和企业加强对转基因食品的检测。

基于PCR反应的分子检测具有速度快、灵敏度高、对模板要求较低等特点，是目前应用最为广泛的转基因食品检测方法。传统的基因组模板制备方法如CTAB法、SDS法，多是采用表面活性物质裂解样品细胞，从而使基因组释放出来，再经过一系列的抽提、分离，将样品中的杂质一一除去，最终得到纯净完整的DNA分子。这些方法的优点是得到的基因组纯度高、完整性好，在分子生物学研究上具有广泛的应用，但是其缺点也是十分明显的——即使经过改进，仍存在反复离心、沉淀的步骤，消耗大量的人力和时间[George S.：A SimpleExtraction Method Suitable for PCR Based Analysis of Plant，Fungal，andBacterial DNA.[J]Plant Molecular Biology.2004，22：71-81]，药品中Tris-饱和酚、异戊醇等存在一定毒性，整个基因组提取过程需要约2h，这显然不能满足快速检测的需要。

目前国内外开发了多种商品化的DNA提取纯化试剂盒，其分离原理有的利用核酸的分子量差异，有的利用特异性膜与DNA结合达到分离、回收的目的，如离子交换柱、磁珠等。这些试剂盒针对不同的材料来源设计了不同的提取方法，操作简单、高效，DNA质量较高，但价格昂贵且提取量少。

碱裂解法[Klimyuk V.I.：Alkai treatment for rapid preparation plantmaterial for reliable PCR analssis.[J]Plant.1993，3：493-494]和高温水煮法[Henry R.J.：Practical Applications of Plant MolecularBiology.Chapman & Hall，1997]作为常见的快速简便的提取基因组的方法，利用碱性、高温等条件对植物组织进行处理，使其细胞膜溶解、蛋白变性，基因组游离出来，得到的基因组不需经过复杂的才纯化过程，即可直接用于PCR反应。有资料介绍，利用碱裂解法提取基因组，每人每天可以提取超过5000个样品。但是，在目前的文献中，这些方法多被应用于幼嫩的根、叶等少数DNA含量丰富的植物组织，对于样品要求较为苛刻。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适于PCR扩增的快速提取植物基因组的试剂盒以及相应的提取方法，以满足植物原材料包括植物尤其是转基因作物分子检测的需要。

碱裂解法提取植物基因组DNA主要包括裂解液裂解、中和液中和以及沉淀液沉淀等步骤，本发明针对这三个关键步骤进行了优化，对裂解液、中和液以及沉淀液作了调整，使其能够最大限度地保留基因组并取出杂质。

基于此，本发明提供一种适于PCR扩增的植物基因组快速提取试剂盒，其包括如下组成：

裂解液：0.3-1.0mol/L NaOH，5-20mmol/L EDTA，10-30mmol/LTris-HCl，30-60mmol/L KCl，0.03-0.08％Tween20，0.05-0.15％TritonX-100，0.05-0.20％PVP，0.05-0.15％牛血清白蛋白，0.05-0.15％DEPC；或其浓缩液

中和液：2-5mol/L NaAc，20-70mmol/L NaCl，20-40mmol/LMgCl₂，20-40mmol/L MnCl₂，pH＝5.2；或其浓缩液

沉淀液：0.05-0.20％mol/L NaAc和0.05-0.20％mol/L NH₄Ac的异丙醇溶液；或其浓缩液。