[发明专利]猪细小病毒LAMP检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及猪细小病毒LAMP诊断试剂盒及其检测方法，属于兽用生物制品领域中的 疫病诊断技术。

背景技术

猪细小病毒(porcine parvo virus，PPV)，可引起母猪的细小病毒病，造成母猪的繁殖障 碍并感染胚胎，导致胚胎死亡。PPV分布广泛，通过水源、食物、交配、胎盘等途径对猪 只感染，并能在外界环境长时间存活且对大部分消毒剂不敏感，难于防治。给养猪业带 来巨大危害。一旦PPV传入阴性猪场，于3个月内几乎100％的猪只都会受到感染，在本病 发生后，猪场可能连续几年不断地出现母猪繁殖失败。

环介导的等温核酸扩增技术(LAMP)是由T.Notomi等发明的一种新型核酸扩增技术 (Notomi，T.，et al.，Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Res.2000， 28，e63.)，该技术依赖4条特异设计的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温 条件下可以高效、高特异地扩增靶序列。近年来，国外已将该技术广泛应用于病原体检测。 Masaki Imai等人(2007)针对四种香酒酵母的ITS序列设计了LAMP特异性引物，建立了 高效的LAMP检测体系。LAMP还可以检测其他与人类相关的病毒，如病毒性出血性败血病 (VHS)、巨细胞病毒(CMV)、埃博拉病毒(EBOV)、慢性伯基特淋巴瘤病毒(EBV)、彩虹 病毒、人类疱疹病毒8型、造血组织坏死病毒(IHHNV)、番茄斑萎病毒、番茄黄化曲叶病 毒等。目前国内外均未见有用于检测猪细小病毒的LAMP试剂盒及在猪细小病毒检测中的 应用。

发明内容

本发明的目的是采用环介导的等温核酸扩增技术(LAMP)建立检测猪细小病毒的 LAMP检测方法，并提供一种用于以上目的的猪细小病毒LAMP检测试剂盒。

猪细小病毒LAMP检测方法的原理及技术路线

本发明是利用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)建 立针对猪细小病毒的检测方法。本方法具有多引物同时扩增，并在两端形成了带有引物功 能的环状结构，这种多引物结合和可自产生引物的原理使其具有了灵敏度高、特异性强等 特点，由于LAMP反应在同管中进行简化了操作步骤及反应产物中包含大量核酸和焦磷酸 镁的沉淀，可以用荧光剂显色观察反应结果，适用于各种实验条件下检测工作的使用。

本发明的方法具体实施

1猪细小病毒LAMP检测方法的建立和验证

(1)反应用试剂的制备

1)引物设计 根据GenBank公布的PPV8个毒株序列为模板，设计以下两对引物， 引物序列为：

F3：ACTAATCCATCAGACGCC

B3：GTCTGTTTCTGAGAGTTTTGG

FIP：TCAGCTGCTGAGAAGTAGAAGTATGGCAGCAAAAGAACACGAC

BIP：TTCATAAAAGAAACTGAACACGCAACACGCTTTGCTCTGAAGA

2)反应体系中溶液的配制(50个反应量)

①引物混合液(PB)：取2.5μl 100pmol/μl F3、2.5μl 100pmol/μl B3、20μl 100pmol/μl FIP，20μl 100pmol/μl BIP混合后加灭菌去离子水5μl，总体系50μl，装至无核酶的塑料容 器中。

②反应缓冲混合液(RB)：取4mmol/μl硫酸镁取50μl、1.6mol/μl甜菜碱50μl、10mmol/μl dNTPs 50μl，溶于475μl PCR级水中定溶至625μl，装至无核酶的塑料容器中。

③反应酶混合液(EB)：取8U/μl Bst大片段DNA聚合酶48μl，0.1μmol/μl DTT 2μl， 装至无核酶的塑料容器中。

④显色剂：取1μl SYBRgreenI(购自Invitrogen公司)溶于49μl PCR级水，装至无核 酶的塑料容器中。

(2)病毒DNA提取试剂(LBBI-DNA)配制