[发明专利]猪圆环病毒2型LAMP检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及猪圆环病毒2型LAMP检测试剂盒及其检测方法，属于兽用生物制品领域 中的疫病诊断技术。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circo virus，PCV)，是目前发现最小的病毒，分为PCV1和PCV2 两个亚型。其中PCV1不引起发病，PCV2型可引起仔猪断奶后多系统衰弱综合症 (Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS)，常在患有由PRRSV引起的猪繁殖 与呼吸综合征的猪只上发现混合感染。感染猪可自排泄物中排出病毒，经口腔、呼吸道途 径感染不同年龄的猪。怀孕母猪经胎盘垂直传播感染仔猪。由于目前没有有效的治疗药物， 所以本病的控制仍以预防为主。

PCV2在病毒分离培养中并不产生CPE，所以单纯的使用该方法很难判断病原是否存 在。目前的检测工作中常使用ELASA方法测定抗体和PCR方法测定抗原。但目前都无法 克服ELASA敏感度低、PCR易出现假阳性结果的确定。

环介导的等温核酸扩增技术(LAMP)是由T.Notomi等发明的一种新型核酸扩增技术 (Notomi，T.，et al.，Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Res.2000， 28，e63.)，该技术依赖4条特异设计的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温 条件下可以高效、高特异地扩增靶序列。近年来，国外已将该技术广泛应用于病原体检测。 Masaki Imai等人(2007)针对四种香酒酵母的ITS序列设计了LAMP特异性引物，建立了 高效的LAMP检测体系。LAMP还可以检测其他与人类相关的病毒，如病毒性出血性败血病 (VHS)、巨细胞病毒(CMV)、埃博拉病毒(EBOV)、慢性伯基特淋巴瘤病毒(EBV)、彩虹 病毒、人类疱疹病毒8型、造血组织坏死病毒(IHHNV)、番茄斑萎病毒、番茄黄化曲叶病 毒等。目前国内外均未见有用于检测猪圆环病毒2型的LAMP检测试剂盒及该方法在猪圆 环病毒2型检测中的应用。

发明内容

本发明的目的是采用环介导的等温核酸扩增技术(LAMP)建立检测猪圆环病毒2型 的LAMP检测方法，并提供一种用于以上目的的猪圆环病毒2型LAMP检测试剂盒。

猪圆环病毒2型LAMP检测方法的原理及技术路线

本发明是利用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)建 立针对猪圆环病毒2型的检测方法。本方法具有多引物同时扩增，并在两端形成了带有引 物功能的环状结构，这种多引物结合和可自产生引物的原理使其具有了灵敏度高、特异性 强等特点，由于LAMP反应操作步骤简单及反应产物中包含大量核酸和焦磷酸镁的沉淀， 荧光剂显色后可以用肉眼观察判定反应结果，适用于各种实验条件下检测工作的使用。 本发明的方法具体实施

1猪圆环病毒2型LAMP检测方法的建立和验证

(1)反应用试剂的制备

1)PCV2 LAMP引物设计

根据GenBank公布的PCV2的6个毒株序列为模板，设计以下两对引物，序列如下：

序列1(PB1)：ATCACAAGGACAACGGAGTG

序列2(PB2)：GCCCCACAATGACGTGTAC

序列3(PB3)：GCTCTGCAACGGTCACCAGA-ACCTCTCTACTGCTGTGAGT

序列4(PB4)：TTGTCAGAAATTTCCGCGGGCT-TTCGTCTTCCAATCACGCTT

2)反应体系中溶液的配制(50个反应量)

①引物混合液(PB)：取100pmol/μl PB1 2.5μl、100pmol/μl PB2 2.5μl、100pmol/μl PB3 20μl，100pmol/μl PB4 20μl混合后加灭菌去离子水5μl，总体系50μl。

②反应缓冲混合液(RB)：取4mmol/μl硫酸镁取50μl、1.6mol/μl甜菜碱50μl、10mmol/μl dNTPs 50μl，溶于475μl PCR级水中定溶至625μl。

③反应酶混合液(EB)：取8U/μl Bst大片段DNA聚合酶48μl，0.1μmol/μl DTT 2μl。