[发明专利]微生物发酵法制备附桂骨痛复方的工艺

说明书

技术领域

本发明属于中药制药领域，具体涉及一种中药复方附桂骨痛复方(FGGT Decoction)的生物发酵工艺和应用。 

背景技术

附桂骨痛是我国拥有自主知识产权的复方，传统的制备工艺主要是：除肉桂粉碎成细粉外，其余七味药加水煎煮二次，合并煎液，滤过，滤液浓缩成稠膏，加入肉桂粉，混匀，减压干燥而成。其功效为温阳散寒，益气活血，消肿止痛，用于阳虚寒湿型颈椎及膝关节增生性关节炎。症状表现为：局部骨节疼痛，屈伸不利、麻木或肿胀，遇热则减，畏寒肢冷等。 

附桂骨痛生产中存在的主要问题是：提取工艺落后，患者服药量大(一次服用6片，一天3次)；有效成分不明确，有效成分含量低。另外复方中君药附子、川乌的主要成分双酯型二萜类生物碱，如乌头碱，既是有效成分，也是毒性成分。因此，传统提取工艺所制附桂骨痛副作用大，用药禁忌较多，限制了药物应用。 

双酯型生物碱经转化可分解成毒性较小的单酯类生物碱。通过优化工艺达到减毒增效作用，是本发明要解决的要点。 

发明内容

本发明的主要目的是提供一种低毒高效、质量可控的附桂骨痛复方的生产工艺。 

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案： 

一种微生物发酵法制备附桂骨痛复方的工艺，由以下步骤完成： 

1)按照附桂骨痛复方的比例称取各味药材，除淫羊藿为全草外，其余为10～20目粗粉； 

2)用蒸馏水浸湿药材后，121℃灭菌20min； 

3)接种10ml 1.8*104个/ml黑曲霉，连续培养7天； 

4)将发酵后的药材加热回流提取3次，加水量分别为药材重量的10，8，6倍，提取时间依次为1.5h，0.75h，0.75h； 

5)过滤步骤4)中所得提取液，4000r/min离心20min，合并上清液，浓缩并定容至150mL。 

所述的黑曲霉为由以下步骤制得的黑曲霉菌悬液： 

1)按照营养琼脂45g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml的比例配制培养基，加热 煮沸，全部溶解后高压蒸汽灭菌，分装于于灭菌培养皿和三角瓶中，凝固得到平板培养基和斜面培养基； 

2)按照牛肉膏10g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml的比例配制培养液，加热煮沸，全部溶解后高压蒸汽灭菌，得到菌悬液培养液； 

3)将黑曲霉接种于平板培养基上，30℃恒温倒置，活化培养3-4天； 

4)平板培养基长满黑曲霉孢子后，在无菌条件下，将单个健康菌落接入到三角瓶中的斜面培养基上，30℃恒温，扩大培养6-7天； 

5)扩大培养后，在无菌条件下，向三角瓶中加入菌悬液培养液，用玻璃棒摩擦菌落表面，将孢子打散成茶状菌液，菌液转于无菌试管，振荡8-10分钟，静置30-40分钟，上层1/2菌液转于另一无菌试管，震荡1-2分钟，用滤纸过滤除去短菌丝，将所得滤液振荡混匀1-2分钟，得到黑曲霉菌悬液； 

6)在无菌条件下，将黑曲霉菌悬液吸取一滴至血球计数板，进行计数。 

所述的附桂骨痛复方为：附子14.5g、川乌7.5g、乳香7.5g、党参11.1g、白芍11.1g、淫羊藿11.1g、当归11.1g，共计74.0g。 

由所述方法制得的附桂骨痛复方中药。 

本发明的有益效果为： 

1、借鉴中医药理论，首次运用生物工程技术发酵附桂骨痛复方，给出了有毒中药减毒增效的新方法。 

2、提取工艺的评价以复方中主要有效成分乌头总生物碱、芍药苷和干浸膏得率三个指标，结合毒理、药理试验评价工艺的药效及安全性，综合指标避免了唯成分论。 

3、项目所用黑曲霉菌种易得，培养条件容易，培养成本低，发酵处理后提取液澄清度高，脱色明显，杂质含量明显降低。且复方中的主要有效成分乌头总生物碱、芍药苷含量明显增高，浸膏得率提高，说明其中的杂质明显降低。毒理试验证明复方毒性降低、药理试验证明药效高于传统方法。 

4、采用微生物发酵法具有优势：成本低廉、对环境友好、简单方便，可为开发新药、提高药物疗效、降低药物毒副作用的研究提供新的手段，为中药的发展开辟新的研究空间。 

附图说明

图1为不同处理对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响 

图2为不同处理对二甲苯致小鼠耳肿胀度的影响