[发明专利]重组圈卷产色链霉菌及其制备方法与应用

权利要求书

1.圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)7100DNik，其保藏号为CGMCC No.3087。

2.权利要求1所述圈卷产色链霉菌的构建方法，是将尼可霉素生物合成基因簇通过重组质粒pNIK导入圈卷产色链霉菌得到重组圈卷产色链霉菌；

1)将圈卷产色链霉菌的基因组DNA用Sau3AI消化，回收40-50kb的DNA片段，同时用BamHI酶切科斯质粒，将回收的DNA片段连入所述科斯质粒，得到重组科斯质粒，用所述重组科斯质粒转化大肠杆菌获得重组科斯质粒文库，筛选得到含有尼可霉素生物合成基因簇片段a的重组科斯质粒的阳性克隆A；筛选得到含有尼可霉素生物合成基因簇片段b的重组科斯质粒的阳性克隆B；所述尼可霉素生物合成基因簇片段a至少含有sanG上游8.9kb和sanG，sanV，sanU，sanT，sanS，sanR，sanQ，sanP，sanO，sanN，sanM，sanL，sanK，sanJ，sanH，sanI，sanF，sanA，sanB，sanC和部分sanDE；所述部分sanDE为sanDE中与sanC相连的500bp片段；

所述尼可霉素生物合成基因簇片段b至少含有sanI，sanF，sanA，sanB，sanC，sanDE，sanX以及sanX下游3.0kb DNA片段；

2)将步骤1)得到的阳性克隆A中所含有的尼可霉素生物合成基因簇片段a插入pLXP，得到重组质粒pLXP-NRPS，使用BamHI酶切pLXP-NRPS，将得到的线性片段转入重组E.coli BW25113/pIJ790菌株中，得到pNIK；

所述重组E.coli BW25113/pIJ790菌株是将步骤1)得到的阳性克隆A中的重组科斯质粒转入E.coli BW25113/pIJ790菌株得到的重组菌株；

所述pLXP按照如下方法构建：用BamHI和XhoI双酶切阳性克隆B中的重组科斯质粒，回收11.0kb DNA片段并连接到pUC19的BamHI和XhoI位点上得到重组质粒pLXP9；然后用EcoRI和HindIII双酶切pLXP9，回收11.0kb DNA片段与经同样处理的pBluescript II KS(-)连接，得到重组质粒pLXP10；再用BamHI和EcoRI酶切pLXP10，将回收的11.0kb DNA片段克隆到pSET152的BamHI-EcoRI位点上从而获得pLXP。

3.一种生产尼可霉素的方法，是发酵权利要求1所述圈卷产色链霉菌得到尼可霉素。

4.含有尼可霉素生物合成基因簇的重组质粒pNIK；所述重组质粒pNIK按照以下方法制备：

1)将圈卷产色链霉菌的基因组DNA用Sau3AI消化，回收40-50kb的DNA片段，同时用BamHI酶切科斯质粒，将回收的DNA片段连入所述科斯质粒，得到重组科斯质粒，用所述重组科斯质粒转化大肠杆菌获得重组科斯质粒文库，筛选得到含有尼可霉素生物合成基因簇片段a的重组科斯质粒的阳性克隆A；筛选得到含有尼可霉素生物合成基因簇片段b的重组科斯质粒的阳性克隆B；所述尼可霉素生物合成基因簇片段a至少含有sanG上游8.9kb和sanG，sanV，sanU，sanT，sanS，sanR，sanQ，sanP，sanO，sanN，sanM，sanL，sanK，sanJ，sanH，sanI，sanF，sanA，sanB，sanC和部分sanDE；所述部分sanDE为sanDE中与sanC相连的500bp片段；

所述尼可霉素生物合成基因簇片段b至少含有sanI，sanF，sanA，sanB，sanC，sanDE，sanX以及sanX下游3.0kb DNA片段；

2)将步骤1)得到的阳性克隆A中所含有的尼可霉素生物合成基因簇片段a插入pLXP，得到重组质粒pLXP-NRPS，使用BamHI酶切pLXP-NRPS，将得到的线性片段转入重组E.coli BW25113/pIJ790菌株中，得到pNIK；

所述重组E.coli BW25113/pIJ790菌株是将步骤1)得到的阳性克隆A中的重组科斯质粒转入E.coli BW25113/pIJ790菌株得到的重组菌株；

所述pLXP按照如下方法构建：用BamHI和XhoI双酶切阳性克隆B中的重组科斯质粒，回收11.0kb DNA片段并连接到pUC19的BamHI和XhoI位点上得到重组质粒pLXP9；然后用EcoRI和HindIII双酶切pLXP9，回收11.0kb DNA片段与经同样处理的pBluescript II KS(-)连接，得到重组质粒pLXP10；再用BamHI和EcoRI酶切pLXP10，将回收的11.0kb DNA片段克隆到pSET152的BamHI-EcoRI位点上从而获得pLXP。