[发明专利]重组圈卷产色链霉菌及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组圈卷产色链霉菌及其制备方法与应用。

背景技术

尼可霉素属于核苷肽类抗生素，与几丁质合成酶的天然底物UDP-N-乙酰葡萄糖胺的结构类似，是该几丁质合成酶的强竞争性抑制剂。由于几丁质是真菌细胞壁、昆虫以及其他无脊椎动物外骨骼的重要组成部分，因此，尼可霉素能够有效的抑制真菌、昆虫和螨虫，而对哺乳动物、蜜蜂和植物无毒或者毒性极低，并且其在自然界中易降解，是一种理想的农用抗生素。田间试验证明尼可霉素对很多植物病害都有很好的防治效果，如小麦白粉病、烟草红斑病、黄瓜菌核病、番茄叶霉病、苹果轮斑病等。同时，研究表明尼可霉素能够有效抑制人体深部感染真菌-白色念珠菌(Candidaalbicans)，尼可霉素Z(Nikkomycin Z)作为口服药物对粗球孢子菌和芽生病菌有明显的疗效。目前，越来越多的人面临着自身免疫系统病(如艾滋病患者、器官移植病人和接受放化疗的癌症患者)和其他原因引起的免疫能力下降而引起的危及生命的真菌感染，因此，作为抗真菌药物的尼可霉素有巨大的应用和开发潜力。

尼可霉素由尼可霉素生物合成基因簇编码的多个酶和蛋白所合成，在尼可霉素生物合成基因簇中有一个途径特异性调控基因sanG，21个结构基因，分别为sanV，sanU，sanT，sanS，sanR，sanQ，sanP，sanO，sanN，sanM，sanL，sanK，sanJ，sanH，sanI，sanF，sanA，sanB，sanC，sanDE，sanX。其中，结构基因构成三个转录单元，分别是sanO-sanV，sanN-sanI，sanF-sanX，其中sanO，sanN，sanF是三个转录单元的第一个基因。尼可霉素生物合成基因簇大于35kb，用一般的分子生物学方法很难得到全长的基因簇。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组圈卷产色链霉菌。

本发明所提供的重组圈卷产色链霉菌，是将尼可霉素生物合成基因簇导入圈卷产色链霉菌得到的重组菌。

其中，所述尼可霉素生物合成基因簇可通过重组质粒pNIK导入圈卷产色链霉菌；

所述重组质粒pNIK按照以下方法制备：

1)将圈卷产色链霉菌的基因组DNA用Sau3AI消化，回收40-50kb的DNA片段，同时用BamHI酶切科斯质粒，将回收的DNA片段连入所述科斯质粒，得到重组科斯质粒，用所述重组科斯质粒转化大肠杆菌获得重组科斯质粒文库，筛选得到含有尼可霉素生物合成基因簇片段a的重组科斯质粒(cosG4)的阳性克隆A；筛选得到含有尼可霉素生物合成基因簇片段b的重组科斯质粒(cosG5)的阳性克隆B；所述尼可霉素生物合成基因簇片段a至少含有sanG上游8.9kb和sanG，sanV，sanU，sanT，sanS，sanR，sanQ，sanP，sanO，sanN，sanM，sanL，sanK，sanJ，sanH，sanI，sanF，sanA，sanB，sanC和部分sanDE；所述部分sanDE为sanDE与sanC相连的500bp片段；

所述尼可霉素生物合成基因簇片段b至少含有sanI，sanF，sanA，sanB，sanC，sanDE，sanX以及sanX下游3.0kb DNA片段；

2)将步骤1)得到的阳性克隆A中所含有的尼可霉素生物合成基因簇片段a插入pLXP，得到重组质粒pLXP-NRPS，使用BamHI酶切pLXP-NRPS，将得到的线性片段转入重组E.coli BW25113/pIJ790菌株中，得到pNIK；

所述重组E.coli BW25113/pIJ790菌株是将步骤1)得到的阳性克隆A中的重组科斯质粒转入E.coli BW25113/pIJ790菌株得到的重组菌株；

所述pLXP按照如下方法构建：用BamHI和XhoI双酶切阳性克隆B中的重组科斯质粒，回收11.0kb DNA片段并连接到pUC19的BamHI和XhoI位点上得到重组质粒pLXP9；然后用EcoRI和HindIII双酶切pLXP9，回收11.0kb DNA片段与经同样处理的pBluescript II KS(-)连接，得到重组质粒pLXP10；再用BamHI和EcoRI酶切pLXP10，将回收的11.0kb DNA片段克隆到pSET152的BamHI-EcoRI位点上从而获得pLXP。

所述重组圈卷产色链霉菌具体可为圈卷产色链霉菌(Streptomycesansochromogenes)7100 DNik CGMCC No.3087。