[发明专利]藜草花叶病毒检测用引物及其检测方法无效
申请号: | 200910089162.6 | 申请日: | 2009-08-05 |
公开(公告)号: | CN101613765A | 公开(公告)日: | 2009-12-30 |
发明(设计)人: | 陈青;陈红运;黄峰;赵文军;朱水芳;陈洪俊 | 申请(专利权)人: | 厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心;中国检验检疫科学研究院 |
主分类号: | C12Q1/70 | 分类号: | C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/94 |
代理公司: | 北京亿腾知识产权代理事务所 | 代理人: | 陈惠莲 |
地址: | 361026福建*** | 国省代码: | 福建;35 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 花叶 病毒 检测 引物 及其 方法 | ||
1.一种藜草花叶病毒检测用引物对,该引物的正向引物序列 SEQ ID NO.1和反向引物序列SEQ ID NO.2的核苷酸序列如下:
SEQ ID NO.1:5′-TGTTATGGGCAGGGCTATG-3′
SEQ ID NO.2:5′-TGTAAATCGCAAGGGCAG-3′。
2.一种检测藜草花叶病毒的方法,该方法以样品总RNA为模 板,利用核苷酸序列为SEQ ID NO.2的引物进行反转录反应合成 cDNA,以合成的cDNA为模板,利用核苷酸序列为SEQ ID NO.1 的引物和核苷酸序列为SEQ ID NO.2的引物进行PCR扩增,反应结 束后根据特异性扩增DNA片段的位置判定藜草花叶病毒的存在。
3.根据权利要求2所述的方法,反转录反应的反应条件是在 20μL反应体系中加入4.75μLDEPC处理水,6μL总RNA,1μL的 10μmol/L的核苷酸序列为SEQ ID NO.2的引物SoMV-R,1μL的 10mmol/L的dNTP,混匀后于65℃保持5min,迅速转移到冰上 骤冷5min;然后向反应管中加入2μL的0.1mmol/L的DTT,4μL5× 反转录缓冲液,1μL的40U/μL的RNA酶抑制剂,0.25μL的200 U/μL的反转录酶,42℃反应50min;72℃15min灭活反转录酶后 获得反转录产物cDNA。
4.根据权利要求2或3所述的方法,其中PCR扩增的反应条 件是在50μL的反应体系中加入30.5μLDEPC处理水,2μLcDNA, 2μL的10μmol/L的核苷酸序列为SEQ ID NO.1的引物SoMV-F,2 μL的10μmol/L的核苷酸序列为SEQ ID NO.2的引物SoMV-R, 10×PCR缓冲液5μL,8μL的2.5mmol/L的dNTP,0.5μL的5U/μL 的DNA聚合酶。
5.根据权利要求4所述的方法,其中PCR扩增的条件为:94℃, 5min;94℃30s,54℃45s,72℃1min,共30个循环;72℃延 伸5min。
6.一种用于检测藜草花叶病毒的试剂盒,该试剂盒包含引物 SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
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