[发明专利]藜草花叶病毒检测用引物及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术，具体地说涉及藜草花叶病毒检测用 引物及其检测方法。

背景技术

藜草花叶病毒(Sowbane mosaic virus，SoMV)为南方菜豆花叶 病毒属(Sobemovirus)成员之一，被列为我国进境植物检疫性有害 生物。SoMV的自然寄主为藜科(Chenopodiaceae)植物。SoMV主 要分布于澳大利亚、欧洲、日本、北美、南美和南非地区。

本研究选择申请人测定的SoMV外壳蛋白基因序列设计一对引 物，建立了SoMV的RT-PCR检测方法，反应结束即可根据扩增片 段的大小判定是否有SoMV。

发明内容

本发明目的在于提供用于SoMV RT-PCR检测的引物序列。

本发明通过分析申请人测定的SoMV外壳蛋白基因序列的基础 上，设计引物。所述的引物对由正向和反向引物组成，其核苷酸序 列如序列表中的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

具体地，本发明提供了一种SoMV检测用引物，该引物的正向 引物序列SEQ ID NO.1(SoMV-F)和反向引物序列SEQ ID NO.2 (SoMV-R)的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.1：5′-TGTTATGGGCAGGGCTATG-3′

SEQ ID NO.2：5′-TGTAAATCGCAAGGGCAG-3′

本发明还提供了一种检测SoMV的方法，该方法以样品总RNA 为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.2的引物SoMV-R进行反转 录反应(RT)合成cDNA。以合成的cDNA为模板，利用核苷酸序 列为SEQ ID NO.1的引物SoMV-F和核苷酸序列为SEQ ID NO.2的 引物SoMV-R进行PCR扩增，反应结束后根据特异性扩增DNA片 段的位置判定藜草花叶病毒的存在。

优选地，上述方法中的PCR反应过程中的退火温度为54℃。

本发明还提供了一种用于检测SoMV的试剂盒，该试剂盒含有 上述引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

具体地，本发明中检测SoMV的方法是以样品总RNA为模板， 进行RT-PCR反应，反应条件是在反应体系中加入超纯水，cDNA， 引物SoMV-F，引物SoMV-R，DNA聚合酶。

更具体地，本发明中检测SoMV的方法是以样品总RNA为模板， 进行RT-PCR反应：

RT的反应条件是在20μL反应体系中加入4.75μL DEPC处理 水，6μL总RNA，1μL SoMV-R(10μmol/L)，1μL dNTP(10 mmol/L)，混匀后于65℃保持5min，迅速转移到冰上骤冷5min； 然后向反应管中加入2μL DTT(0.1mmol/L)，4μL 5×反转录缓冲液， 1μL RNA酶抑制剂(40U/μL)，0.25μL反转录酶(200U/μL)，42℃ 反应50min；72℃15min灭活反转录酶后获得反转录产物cDNA。

PCR的反应条件是在50μL的反应体系中加入30.5μLDEPC处 理水，2μL cDNA，2μL SoMV-F(10μmol/L)，2μL SoMV-R(10 μmol/L)，10×PCR缓冲液5μL，8μL dNTP(2.5mmol/L)，0.5μL DNA 聚合酶(5U/μL)。PCR的反应参数是：94℃，5min；94℃30s， 54℃45s，72℃1min，共30个循环；72℃延伸5min。

当然，可以根据本发明给出的引物的扩增产物序列设计其他引 物，以适用于不同的PCR检测方法。

进一步，还可以将本发明引物及相关试剂组装成试剂盒，以方 便使用。

根据SoMV外壳蛋白基因序列设计的本发明的引物是经过大量 筛选得到的，而且应用该引物及本发明中的检测方法准确性高，能 够快速地判断样品是否有SoMV，为进出口安全提供了保证。

附图说明

图1是藜草花叶病毒的RT-PCR检测结果，其中M：DL2000 DNA ladder；1.SoMV；2.SBMV；3.SCPMV；4.RYMV；5.健康对照。