[发明专利]肝脏前体细胞及其制备方法与应用

权利要求书

1.肝脏前体细胞，是由人胚胎干细胞或人诱导的多潜能干细胞分化获得表达甲胎蛋白、角蛋白19和角蛋白7的细胞，其具有增殖能力并具有向类肝实质细胞和类胆管细胞的双向分化潜能。

2.根据权利要求1所述的肝脏前体细胞，其特征在于：所述人胚胎干细胞为人胚胎干细胞系。

3.根据权利要求2所述的肝脏前体细胞，其特征在于：所述人胚胎干细胞系为下述任一种细胞系：BG01，BG02，BG03，BG04，SA01，SA02，SA03，ES01，ES02，ES03，ES04，ES05，ES06，TE03，TE32，TE33，TE04，TE06，TE62，TE07，TE72，UC01，UC06，WA01，WA07，WA09，WA13和WA14；所述编号为NIH的编号。

4.制备权利要求1-3中任一所述肝脏前体细胞的方法，包括如下步骤

1)将人胚胎干细胞或诱导的多潜能干细胞在内胚层诱导培养基I上培养；

2)步骤1)获得的细胞在内胚层诱导培养基II上培养；

3)步骤2)获得的细胞在内胚层诱导培养基III上培养；

4)步骤3)获得的细胞肝脏内胚层诱导培养基上培养，得到肝脏内胚层细胞；

5)将所述肝脏内胚层细胞在STO细胞作为饲养层上用肝脏前体细胞培养基进行培养，获得肝脏前体细胞；

所述内胚层诱导培养基I为含有质量百分含量0.02％-1％的牛血清白蛋白组分V和50-200ng/ml人活化素-A的基础细胞培养基；所述内胚层诱导培养基II为含有质量百分含量0.02％-1％的牛血清白蛋白组分V，体积百分含量0.05％-0.5％的胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液和50-200ng/ml人活化素-A的基础细胞培养基；所述内胚层诱导培养基III为含有质量百分含量0.02％-1％的牛血清白蛋白组分V，体积百分含量0.5％-2％的胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液和50-200ng/ml人活化素-A的基础细胞培养基；所述肝脏内胚层诱导培养基为含有20-60ng/ml人成纤维细胞生长因子-4和10-30ng/ml人骨成型蛋白-2的肝细胞培养基；

所述肝脏前体细胞培养基为含有5-25mM HEPES，体积比分含量0.5％-2％的胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液，质量百分含量0.02％-1％的牛血清白蛋白组分V，2-20mM尼克酰胺，0.2-2mM的二磷酸化抗坏血酸，0.02-0.2μM地塞米松，和5-40ng/mlEGF的基础细胞培养基。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述方法还包括用流式细胞仪分选表达神经性钙黏附蛋白表面蛋白的细胞。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述基础细胞培养基为MEM、DMEM、BME、DMEM/F12、RPMI1640或Fischers。

7.根据权利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中，人胚胎干细胞或诱导形成的多潜能干细胞在内胚层诱导培养基I上培养24h；所述方法中，步骤1)获得的细胞在内胚层诱导培养基II上培养24h；所述方法中，步骤2)获得的细胞在内胚层诱导培养基III上培养24h；所述方法中，步骤3)获得的细胞肝脏内胚层诱导培养基上培养5天。

8.根据权利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中，还包括肝脏前体细胞的传代步骤；肝脏前体细胞的传代方法为将所述肝脏前体细胞用胰酶-EDTA消化液消化，然后在STO细胞作为饲养层的肝脏前体细胞培养基上培养。

9.根据权利要求4-8中任一所述的方法，其特征在于：所述人胚胎干细胞为可从商业途径获得的人胚胎干细胞系；

所述可从商业途径获得的人胚胎干细胞系优选为下述任一种细胞系：BG01，BG02，BG03，BG04，SA01，SA02，SA03，ES01，ES02，ES03，ES04，ES05，ES06，TE03，TE32，TE33，TE04，TE06，TE62，TE07，TE72，UC01，UC06，WA01，WA07，WA09，WA13和WA14；所述编号为NIH的编号。