[发明专利]肝脏前体细胞及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及肝脏前体细胞及其制备方法与应用。

背景技术

人胚胎干细胞具有无限增殖的能力和分化的全能性，在合适的条件下可以分化为人体的各种细胞类型(Thomson et al.，1998)。因此，人胚胎干细胞有为各种细胞提供来源的潜力，具有巨大的应用潜能，如应用于发育过程中细胞谱系决定的机制的研究，或者是应用于各种退行性疾病进行的细胞移植。在人胚胎干细胞可分化产生的各种谱系中，肝脏细胞受到了人们格外的关注。这是因为肝脏在人体内代谢过程中起到重要的作用，具有许多重要功能，包括糖原合成，分解红细胞，合成血浆蛋白，以及解毒等等。最近，有许多研究小组都成功的将人或者小鼠胚胎干细胞分化到肝脏谱系(Basma et al.，2009；Drobinskaya et al.，2008；Gouon-Evanset al.，2006；Hay et al.，2008b；Soto-Gutierrez et al.，2006)。。

在早期肝脏组织生成的过程中，肝脏前体细胞是肝脏实质的主要组成部分(Zaret，2008)。通过小鼠和人的发育学研究发现，这些肝脏前体细胞是成熟肝实质细胞以及肝内胆管上皮细胞的共同前体。肝脏前体细胞向肝胆两个谱系的分化大约是在怀孕中期才逐渐确定的(Walkup and Gerber，2006)。人们通过从人和小鼠胎肝中分离肝脏前体细胞并进行体外培养的方法，已经对肝脏前体细胞的特性作了初步的研究(Dan et al.，2006；Oertel et al.，2008；Schmelzer et al.，2007；Strick-Marchand and Weiss，2002；Suzuki et al.，2002；Tsuchiya et al.，2005)。在体外培养中，人肝脏前体细胞表现出强大的增殖能力，同时表现出稳定的表型(Dan et al.，2006)。当置于合适的条件下，肝脏前体细胞可以分化为表达ALB，储存糖原的类肝实质细胞；以及分化为表达KRT19的胆管细胞(Schmelzer et al.，2007)。

尽管肝脏前体细胞的增殖能力和肝胆双向分化潜能都已经被人们证实，但是这些肝脏前体细胞的起源和功能目前还是一个存有争议的领域。这可能主要是因为目前人们只能从肝脏中直接分离获得肝脏前体细胞，而早期人胚胎的缺乏极大的限制了该领域的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种肝脏前体细胞及其制备方法与应用。

本发明所提供的肝脏前体细胞，是由人胚胎干细胞(人ES细胞)或人诱导的多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells，人iPS细胞)分化获得表达早期肝脏标志蛋白甲胎蛋白(AFP)和表达胆管的标志蛋白角蛋白19(KRT19)和角蛋白7(KRT7)的细胞，其具有增殖能力并具有向类肝实质细胞和类胆管细胞的双向分化潜能。

其中，所述人胚胎干细胞来源见表1。

表1.可从商业途径获得的人胚胎干细胞系

本发明的另一个目的是提供一种制备肝脏前体细胞的方法。

本发明所述的制备肝脏前体细胞的方法，包括如下步骤：

1)将人胚胎干细胞或诱导的多潜能干细胞在内胚层诱导培养基I上培养；

2)步骤1)获得的细胞在内胚层诱导培养基II上培养；

3)步骤2)获得的细胞在内胚层诱导培养基III上培养；

4)步骤3)获得的细胞肝脏内胚层诱导培养基上培养，获得肝脏内胚层细胞；

5)所述肝脏内胚层细胞在STO细胞作为饲养层上用肝脏前体细胞培养基进行培养，获得肝脏前体细胞。

所述内胚层诱导培养基I为含有质量百分含量0.02％-1％的牛血清白蛋白组分V和50-200ng/ml人活化素-A的基础细胞培养基；其中，牛血清白蛋白组分V的含量优选为0.02％-0.1％，尤其优选为0.05％；人活化素-A的含量优选为80-150ng/ml，尤其优选为100ng/ml；

所述内胚层诱导培养基II为含有质量百分含量0.02％-1％的牛血清白蛋白组分V，体积百分含量0.05％-0.5％的胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液和50-200ng/ml人活化素-A的基础细胞培养基；其中，牛血清白蛋白组分V的含量优选为0.02％-0.1％，尤其优选为0.05％；人活化素-A的含量优选为80-150ng/ml，尤其优选为100ng/ml；胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠混合补充液的含量优选为0.05％-0.15％，尤其优选为0.1％；