[发明专利]一种鼠骨髓瘤细胞NSO及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种鼠骨髓瘤细胞NSO及其制备方法与应用。

背景技术

哺乳动物细胞大规模发酵是确保抗体药物能够批量生产供应临床使用的基础，也 是现代生物制药领域中最为关键的技术。美国食品药品管理局在2000年1月-2004年 12月批准上市的31种生物技术药物中，约70％为哺乳动物细胞表达的重组蛋白。目 前国际上主要用CHO、SP2/0、NSO等三种细胞系生产重组蛋白治疗药物。例如治疗淋 巴瘤的Rituximab，治疗类风湿性关节炎的Infliximab，和预防急性器官排斥的 Daclizumab分别是用CHO，NSO和SP2/0表达的。

目前我国批准上市的由哺乳动物细胞表达得到的药物产品很少，只有促红细胞生 成素(EPO)、CHO基因工程乙肝疫苗、以及最近批准上市的治疗性抗体药物益赛普(有 效成分相当于美国食品药品管理局批准的Enbrel)和泰欣生(有效成分相当于美国食 品药品管理局批准的Erbitux)等少数几种生物技术药物。主要是由于哺乳动物细胞 表达的技术复杂和控制要求高，而这已成为我国生物技术药物产业化最难跨越的“门 槛”。

NSO细胞是小鼠浆细胞瘤细胞，与CHO细胞最大的区别在于NSO细胞不需要基因 扩增的过程就可以得到高表达细胞株。这一特点不但可以节约6个月的工程细胞株 开发时间，而且可以大大简化药物申报时对细胞株稳定性的鉴定工作。而且NSO细胞 是悬浮培养的细胞，不需要从贴壁到悬浮的驯化过程，这也是其相对于CHO细胞的优 势之一。因此，加强对NSO细胞的研究，从而实现用NSO细胞株大规模生产药物产品， 将会对我国的生物技术药物产业化产生重要意义。

目前，在细胞培养过程中普遍使用含有牛血清的细胞培养液，但是牛血清的使用 能带来其它动物来源成份、杂蛋白及一些不安全因素，这些成份越多，纯化就越复杂、 纯化成本也越高，生物制品原液损失越大，而且牛血清的成本远远高于培养液中其它 成份的成本，所以使用牛血清会大大提高生物制品的成本。因此采用低血清、无血清 培养液培养细胞不但可以有效降低纯化成本和产品损失，而且还可以降低细胞培养液 的总成本，进而能提高生物制品成品率和利润率。采用无血清无动物来源成分培养基 进行细胞培养制药是21世纪生物制药发展趋势，美国FDA和美国农业部已经严格控 制在细胞培养中胎牛血清的使用。

细胞膜脂类的构成和膜流动性可影响细胞的功能。膜流动性也受到脂肪酸、磷脂 和胆固醇的影响。多数细胞系需要脂类维持在无血清培养基中生存，脂类难溶于水， 常与白蛋白一起加入或制成微乳，才能起到较好的效果。常见的添加脂类为胆固醇、 低密度脂蛋白、大豆磷脂和亚油酸或油酸。但脂类的添加会引入动物来源成分，增加 感染机率和纯化难度，同样会增加纯化成本。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种在无血清无脂类培养基中生长的鼠骨髓瘤细胞 NSO。

本发明所提供的在无血清无脂类培养基中生长的鼠骨髓瘤细胞NSO，是按照包括 如下步骤的方法得到的：

(1)将鼠骨髓瘤细胞NSO接种于含血清的细胞培养基中进行原代培养；

(2)将步骤(1)得到的鼠骨髓瘤细胞NSO进行传代培养，传代培养过程中每代 所用的细胞培养基中血清浓度均在前一代培养中所用细胞培养基中血清浓度的基础 上进行稀释；

(3)当传代培养至所用的培养基中血清浓度为0.2-0.3％(体积百分含量)时， 用5-氮胞苷处理传代培养后的鼠骨髓瘤细胞NSO；

(4)将步骤(3)处理后的鼠骨髓瘤细胞NSO接种至无血清、含有牛血清白蛋白 的细胞培养基中培养；

(5)将步骤(4)获得的细胞接种至无血清且不含牛血清白蛋白的细胞培养基中 培养；得到在无血清无脂类培养基中生长的鼠骨髓瘤细胞NSO。

步骤(2)中，所述稀释的倍数优选为2倍。

步骤(2)中，所述传代培养过程中所用的培养基是按照如下方法得到的：将含 1-2％(体积百分含量)牛血清白蛋白的杂交瘤无血清培养基与等体积的前一代培养 所用的培养基进行混匀。

步骤(4)中，所用的无血清、含有牛血清白蛋白的细胞培养基为无血清、含1-2 ％(体积百分含量)牛血清白蛋白的杂交瘤无血清培养基；

步骤(5)中，所用的无血清且不含牛血清白蛋白的细胞培养基为无血清、无牛 血清白蛋白的杂交瘤无血清培养基；