[发明专利]一种检测癌胚抗原mRNA表达量的方法及专用试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测癌胚抗原mRNA表达量的方法及专用试剂盒。

背景技术

消化道肿瘤，包括食道癌、胃癌、直肠癌、结肠癌等，是危害人类健康的常见 恶性肿瘤，世界各国因地理环境、生活习惯的不同，各种肿瘤的发病率有很大差异。 以食道癌为例，全世界每年约30万人死于食道癌。我国是食道癌的高发地区，每 年因食道癌死亡者约15万人，占全部恶肿瘤死亡总数近1/4。我国食道癌的发病率 有明显的地区分布特点，如华北太行山地区和四川盆地西北部地区呈不规则同心圆 的分布，圆心发病率最高，向四周递减。沿海地区由东北向西南发病率逐渐降低， 地区变动，距离远近，食道癌的发病率高低相差可达数十倍。

消化道肿瘤的治疗方法有多种，如外科手术切除、放射治疗、化学治疗、中药 治疗等。目前，手术切除为上述肿瘤综合治疗方法中的首选，然而在手术切除技术 已达到相当成熟和普及的同时，肿瘤切除后的高复发和转移率已成为阻碍患者生存 期提高的主要原因。手术前癌细胞由于自然或侵袭性医源性因素脱落至外周血并随 血液转移至原发器官外，形成循环肿瘤细胞，但是由于受检测方法灵敏度及特异性 较低的限制，该微量的癌细胞未能被检测到，这些癌细胞随血液到达外周组织并处 于休眠状态，当患者机体免疫功能下降时，如大手术或移植后应用抗排斥免疫抑制 剂等，休眠的癌细胞就有可能被激活，随血液循环返回到原发器官，并恢复增殖， 从而导致了肿瘤的复发。肿瘤的转移是临床治疗的一大难题，也是肿瘤致死的一个 重要原因。目前，肿瘤转移的发现和确定，主要根据影像学(X光片、CT、磁共振、 PET等)或病理形态来诊断。影像学检查中，病灶或转移灶需要形成一定大小才能 够被仪器成像和有效分辨；病理形态检查中，需要取到合适的检测标本，且有相当 数量可观察到的肿瘤细胞存在。因此，无论是影像学诊断还是病理学诊断，都是肿 瘤形成及转移后晚期、存在大量恶变细胞积累的阶段，如果在肿瘤发生转移的早期， 能够发现并确定其转移，则可以指导临床治疗方案的设计，并提供有力的预后依据。 血行播散是肿瘤转移的主要途径之一，所以在肿瘤患者外周血中进行肿瘤细胞基因 表达、肿瘤特异性标记产物检测是了解肿瘤转移情况的一种有效方法，对肿瘤形成 及转移的诊断具有极大的帮助，但是在肿瘤转移发生的早期，外周血中的肿瘤细胞 一般很少，无法完全依赖病理形态检查，未形成转移灶或转移灶未达到一定体积时， 影像学诊断也无能为力，因此，循环血中的微量肿瘤细胞基因表达和一些特异性产 物检测的研究，引起了学者们的广泛关注。

外周血中肿瘤相关抗原基因mRNA的定量测定，有利于肿瘤的早期诊断，治疗 方案的确定以及预后的判断。随着分子生物学技术的飞速发展及其在医学研究中的 广泛应用，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测外周血中微量肿瘤细胞已 成为可能并被尝试。

实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入一对引物的同时加入一个 特异性荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。目前常用的Taqman 荧光探针为寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针 完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，故检测不到荧光；在PCR扩增 过程中，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧 光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。在PCR扩增过程中，每个循环 结束后检测一次荧光强度，整个反应结束后，便可得到一条工作曲线，根据该曲线 可对未知模板进行定量分析。实时荧光定量PCR技术是一种能够准确定量mRNA的 检测方法，通过检测肿瘤特异性基因mRNA的表达以判断循环肿瘤细胞的存在。