[发明专利]一种融合肝素酶及其编码基因

说明书

技术领域

本发明涉及酶工程和生物催化领域，特别涉及融合肝素酶及其编码基因与应用。

背景技术

肝素酶(heparinase)是一类作用于肝素的多糖裂解酶，在许多种微生物中发现，包括棒杆菌Corynebacterium sp.(高宁国等，肝素酶产生菌的筛选及发酵条件，微生物学报1999 Vol.39：64-67)、鞘胺醇杆菌Sphingobacterium sp.(高宁国等，鞘胺醇杆菌肝素酶的产生，微生物学报2003 Vol.43：813-816)、枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis(王忠彦等，肝素酶产生菌的筛选及其粗酶性质的研究，四川大学学报(自然科学版)2002 Vol.39：777-779)、环状芽孢杆菌Bacillus circulans(Yasutaka Tahara et al.，Purification and characterization of heparinase that degrades both heparin and heparin sulfate from Bacilluscirculans BioSci.Biotechnol.Biochem.2002 Vol.66：1181-1184)、解肝素拟杆菌Prevotella heparinolytica(Kazuyuki Sugahara et al.，Characterization of heparinase from an oral bacterium Prevotella heparinolytica J.Biochem.1998 Vol.123：283-288)、粪便拟杆菌Bacteroides stercoris HJ-15(Dong Hyuu Kim et al.，Purification and characterization of a novel heparinase from Bacteroides stercoris HJ-15 J.Biochem.2000 Vol.128：323-328)和肝素黄杆菌Flavabacterium heparinum(Sasiekharan，R.1991 Ph.D.Thesis，Havard University)。但是来自肝素黄杆菌的肝素酶是商业化的唯一来源。

肝素酶的研究具有十分重要的意义(Sasiekharan，R.1991 Ph.D.Thesis，Havard University；Sasiekharan，R.et al.，A comparative analysis of the primary sequences and characteristics of heparinase I，II，and III from Flavobacterium heparinum Biochemical and Biophysical Research Communication1996 Vol.229：770-777)：肝素酶是多糖裂解酶的一种，用于研究肝素酶及其底物多糖肝素之间的相互作用有助于阐明多糖裂解酶的作用机制；肝素酶可以用于解析肝素等复杂粘多糖的结构及其生物学功能；肝素酶可以用于解析人体内的凝血和抗凝血机制；肝素酶可以用作临床血液肝素化的去除，防止手术后出血；肝素酶用于PCR反应前血液制品的处理；肝素酶可以用于制备低分子的抗凝血药物低分子量肝素。

来自肝素黄杆菌的肝素酶主要有三种，分别命名为肝素酶I(EC 4.2.2.7)、II(NO EC code)和III(EC 4.2.2.8)(Robert J.Linhardt et al.，Purificationand characterization of heparin lyases from Flavobacterium heparinum JBC1992 Vol.267：24347-24355)。其中肝素黄杆菌的肝素酶I(HepA)是目前为止研究最充分的肝素酶之一，其在低分子肝素的生产和体外血液循环中肝素的去除上的应用已有报道，具有巨大的市场开发价值。

肝素酶I通常是从肝素黄杆菌发酵液中提纯获得的，通常需要经过多步的色谱纯化，收率比较低。肝素黄杆菌增长速度慢，肝素酶的生产稳定性差，而且，产肝素酶需要价格昂贵的肝素诱导，增加了酶的成本，因而重组菌生产肝素酶I受到极大的关注，但通常情况下重组肝素酶I极容易形成包涵体，需要复杂的复性过程才能形成活性蛋白。