[发明专利]海洋微生物溶菌酶保护冻干粉的制造方法

说明书

技术领域

本发明涉及海洋微生物酶工业保存领域，特别是涉及均一、稳定、高活性的海洋微生物溶菌酶保护冻干粉的制造方法。

背景技术

浩瀚的海洋是地球上生命的摇篮，它覆盖地球表面积的71％，海水总量占地球总水量97％，尚未被利用的海洋与海岸的有效面积比陆地大5-10倍。海洋微生物是海洋生物的重要成员。

海洋的生态环境十分独特，包罗了高盐、高压、低温(尤其是深海)、低光照、寡营养等特点，还有无光照以及局部高温的极端环境。来自海洋的微生物都是适应了极端环境的极端微生物，往往能产生不同于陆地来源的分子结构新颖独特的新活性物质，而且其活性一般大大超过陆栖微生物。海洋微生物所产生的酶例如海洋溶菌酶具有一些较之相应的陆生动、植物和微生物产生的酶更为独特的性质，如在低温条件下具有相对高的活力，最适pH和反应温度适中，作用pH范围宽，在碱性环境下稳定等，这些结构和功能新颖的酶类具有独特的生理、药理及生化活性，在医药、食品和酶工业等领域中有着广阔的应用前景和开发潜力。

在过去，生物工程和食品加工业用溶菌酶，都是从蛋清中分离获得。鸡蛋清溶菌酶最适作用温度为50℃，在室温下活性较低，制成各种酶制剂具体表现产品生物活性低，易失活，要保存在低温下，这给运输储存带来诸多问题，能耗高，成本高，价格昂贵。例如美国Sigma公司及丹麦sanoyo公司已溶菌酶结晶出售，价格昂贵6000美元/Kg。

由中国水产科学研究院黄海水产研究所开发一种新的海洋微生物溶菌酶，海洋微生物溶菌酶(Marine Microorganism Lysozyme)是一种新型的海洋微生物酶，来自海洋微生物，具有嗜低温、抗氧化作用及溶菌谱广等优点。这种结构和功能新颖的酶类具有独特的生理、药理及生化活性，在医药、食品和酶工业等领域中有着广阔的应用前景和开发潜力。但目前，关键的问题在于如何得到一个稳定而高活性的酶制剂。

在生物药品领域，冷冻干燥技术是一项极为重要的制剂工艺。据文献报道，约有14％的抗生素类药品、92％的生物大分子类药品、52％其它生物制剂需要冻干。 在生物药品冷冻干燥过程是将含水药品冻结成固态后，在低温、真空状态下，使其中的水分升华或解吸排除，以达到药品能长期保存的一种方法，对提高医药工业技术水平具有特殊重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术存在不足之处，在已开发具有独特生理、药理及生化活性的新的海洋微生物溶菌酶基础上，开发提供一种稳定、活性高的海洋微生物溶菌酶保护冻干粉的制造方法。

本发明提供的海洋微生物溶菌酶保护冻干粉的制造方法，包括下列步骤：

①预冻

将浓度为0.1-0.9mol/L，优选为0.3-0.7mol/L，更优选为0.5mol/L的二糖，例如麦芽糖、蔗糖或海藻糖，优选为海藻糖，与质量浓度为0.5-25g/L，优选为15-25g/L，更优选为20g/L的吐温80(聚环氧乙烷失水山梨糖醇单油酸酯或聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)等体积于预冷容器中混合，再以体积比(上述混合液与溶菌酶溶液体积比)为1∶1加入海洋微生物溶菌酶溶液(简称溶菌酶溶液)，混合均匀后于预冻温度-70～-90℃，优选为-80℃进行预冻，预冻时间3～5小时，优选3小时；

②二级冷冻升华干燥

将步骤①预冻物料转移至冷冻干燥机的筛盘中，于冷冻室内进行初级冷冻升华干燥，初级冷冻升华干燥温度为-40至-50℃，优选为-45℃，真空压力为10-15Pa，优选为13Pa，冷冻时间25至35小时，优选为30小时，使物料中水份直接升华至基本上完全升华后转入次级冷冻升华干燥，在次级冷冻升华干燥中，使温度在5-8小时，优选6小时内以0.2℃/分的加热速度由-40至-50℃升至20℃，压力保持不变，冷冻升华干燥后得到海洋微生物溶菌酶保护冻干粉，然后于4℃保存贮放。