[发明专利]能与乳链菌肽结合的突变体蛋白及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及能与乳链菌肽结合的突变体蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

乳链菌肽(nisin)是某些乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)产生的一个小肽，对引起食品腐败和对人体健康有害的葡萄球菌、链球菌、分支杆菌、李斯特氏菌等许多革兰氏阳性菌有强烈抑制作用，且对人体安全无毒，是一种被世界50多个国家和地区广泛应用于罐头食品、肉制品、乳制品等领域的高效天然食品防腐剂。同时，乳链菌肽在医药和轻工等领域也极具应用潜力。近年来，随着回归大自然的呼声日益高涨，用高效、无毒的天然防腐剂取代传统的化学合成防腐剂是保障人类健康的迫切需要，也是世界潮流所趋，因此乳链菌肽的生产和应用能同时产生良好的经济效益和社会效益。

为能更好地推动乳链菌肽的广泛应用，进一步提高乳链菌肽产生菌的发酵效价、提高乳链菌肽产量、降低成本等成为乳链菌肽研究者和生产者面临的重要课题。传统的菌种诱变筛选、发酵工艺改良等手段虽能在一定程度上提高产量，但存在过程繁琐、工作量大且成功率低等不足。而随着对乳链菌肽生物合成过程的逐步深入了解和乳酸菌基因工程手段的完善和提高，通过基因工程的手段来提高乳链菌肽的产量在近年来已逐步引起了研究者和生产者的关注。成熟的nisin分子由34个氨基酸组成，分子量约为3510Da。其生物合成基因簇包含结构基因(nisA)、成熟基因(nisBTCP)、免疫基因(nisI，nisFEG)及调控基因(nisRK)等，在核糖体上合成前乳链菌肽(prenisin)分子后，通过翻译后修饰产生羊毛硫氨酸和β-甲基羊毛硫氨酸等稀有氨基酸，并在切除前导肽后赋予nisin分子以抑菌活性。

在了解nisin生物合成过程的基础上，目前已有尝试通过基因工程手段提高其产量的报道。如Cheigh CI等尝试通过增加nisin生物合成中的结构基因nisZ、调控基因nisKR以及免疫基因nisFEG的拷贝数的方法来提高乳链菌肽产量，结果发现nisZ的增加没有效果，而nisKR及nisFEG拷贝数的增加虽在一定程度上提高了产量，但却影响了菌体的生长速度(Cheigh et al.Biotechnology Letters(2005)27：155-160)；Wu Z等利用Mu转座复合体突变技术筛选出影响nisin产量的12个突变体，但没有一个能提高产量且其中三个突变体的产量显著降低(Wu et al.Journalof Applied Microbiology(2009)106：41-48)；Kim W等利用转入包含免疫基因nisI的60kb大质粒，获得了一定的提高产量的结果(Kim W et al.Applied MicrobiologyBiotechnology(1998)50：429-433)。后期研究结果发现，NisI蛋白在体外与nisin结合能提高其活性(Koponen O et al.FEMS Microbiology Letters  (2004)231：85-90)；定位于产生菌细胞膜上的NisI蛋白表达量的增加可结合更多的nisin分子，从而提高了产生菌自身抵抗nisin的能力，使得nisin产量也得以提高。由上可见，利用nisin产生菌中的免疫蛋白NisI与nisin分子结合的特性，在细胞表面阻止nisin对自身菌体的破坏，增强菌体对nisin的抗性，是提高nisin产量的一条可行途径。

在一些不产生nisin却对nisin有天然抗性的菌株中，是不含有NisI免疫蛋白的，其对nisin的抗性是由nisin抗性基因(nisin resistance gene，nsr)编码的一个分子量约为35kDa的nisin抗性蛋白(nisin resistance protein，NSR)决定的。汤莎等从新鲜牛奶样品中分离得到一株不产nisin但具nisin抗性的乳酸乳球菌菌株L.lactis TS1640，经抗性检测、PCR扩增和DNA序列测定等证明其含有nisin抗性基因nsr，该基因编码318aa的NSR(汤莎等，微生物学报(2001)41：536～541)。NSR蛋白C末端存在一个保守的末端特异性蛋白酶结构域，体内体外研究结果表明NSR能行使蛋白酶功能，特异性地从nisin分子的C末端降解nisin，使其抑菌活性大大降低，从而行使乳链菌肽抗性功能(Sun Z et al.Antimicrobial Agents andChemotherapy(2009)53：1964-1973)

发明内容

本发明的目的是提供一种能与乳链菌肽结合的突变体蛋白。