[发明专利]一种制备超低分子量肝素的方法

权利要求书

1、一种制备超低分子量肝素的方法，是用麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白降解肝素，得到超低分子量肝素；所述麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID №：1所示；所述麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白的用量是0.4-4.0IU/g肝素，优选是1.6IU/g肝素。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白按照以下方法制备：将质粒pMal-hepA转化大肠杆菌TB1，得到含有pMal-hepA的重组大肠杆菌TB1(pMal-hepA)，培养重组大肠杆菌TB1(pMal-hepA)，诱导表达，得到麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白；

所述质粒pMal-hepA是将具有序列表中SEQ ID №：2的DNA序列的所述麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白编码基因插入pMal-p2x或pMal-c2x载体的BamHI和PstI识别位点间得到的重组载体。

3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述肝素来自肝素溶液，肝素在肝素溶液中的浓度为1-100g/L，优选是50g/L。

4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述肝素溶液是用如下方法配制的：将0.05-5g的肝素加入到50ml含3.5mM CaCl₂和200mM NaCl的水中，然后用1M HCl溶液调节pH至7.0。

5、根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述降解的条件是：温度10-45℃，时间9-24h。

6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述降解的条件是如下1)或2)或3)或4)或5)或6)：

1)温度是25-35℃，时间是9-24h；

2)温度是30℃，时间是9-24h；

3)温度是30℃，时间是9h；

4)温度是30℃，时间是14h；

5)温度是30℃，时间是19h；

6)温度是30℃，时间是24h

7、根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述降解在当反应液在235nm下的吸光度为200-280时终止，优选是在吸光度为210-270时终止。

8、根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于：所述降解终止是通过调节pH至2.0来实现的。

9、根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于：所述降解后还包括如下的纯化步骤：

1)降解终止时的反应液经过孔径为0.2微米的纤维素膜过滤，得到初滤液；

2)将步骤1)得到的初滤液用截留分子量为3000-5000Da的超滤膜进行过滤，得到次滤液；

3)将步骤2)得到的次滤液与体积是次滤液体积2-3倍的乙醇混合，离心，收沉淀；

4)将步骤3)得到的沉淀用丙酮洗涤，减压蒸干，得到纯化的超低分子量肝素。