[发明专利]一种制备超低分子量肝素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种制备超低分子量肝素的方法。

背景技术

肝素是由己糖醛酸(L-艾杜糖醛酸、D-葡萄糖醛酸)和D-硫酸氨基葡萄糖以1→4糖苷键交替形成的粘多糖，具有六糖或八糖重复单位的线形链状结构，其分子量在3000-37000之间，平均分子量为15000。自1916年首次发现肝素以来，其在医药方面作为抗凝试剂和抗栓试剂的应用越来越受到人们的关注。此外，肝素还具有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌、调血脂等多种生物学功能。但是，由于肝素具有抗凝活性，所以大量使用肝素会引起出血和诱导血小板减少等副作用，从而大大限制了肝素在临床上的应用。

低分子量肝素(简称LMWH)(Robert J.Linhardt，PH.D.And Nur SibelGuany，M.S，Seminar in Thrombosis and Hemostasis，1999，25(3)：5-16)是在分离普通肝素时得到的一些低分子量组分，或肝素裂解后产生的小分子片段，长度约为普通肝素的1/3。LMWHs分子量在3000-8000Da之间，平均分子量为5000Da左右。与普通肝素相比，通过体内、外实验发现，在同等剂量下，LMWHs的抗凝作用小于肝素，但其体内和体外抗血栓作用明显强于肝素。

超低分子量肝素(Ultra Low Molecular Weight Heparin，以下简称uLMWH)的概念，虽没有明确的定义，但应是指二糖以上而低于低分子量肝素平均分子量的一系列寡糖(数均分子量在2500以下)，超低分子量肝素尽管具有很高的抗Xa因子活性，但其抗IIa因子活性却很低。人们还发现，一些包括二糖在内的寡糖也有某些生理活性。

Maetzke等(Maetzke J，Hinrichs R，Schneider L A.et.al.Unexpecteddelayed-type hypersensitivity skin reaction to theultra-low-molecular-weight heparin fondarinux.Allergy.2005，60：413-415)发现某些患者使用了肝素和LMWH后会出现延迟型超过敏症状。如一位59岁的老太太在使用nadroparin(用亚硝酸降解法获得的LMWH)三天后出现了局部皮肤瘙痒的反应。而使用超低分子量肝素-fondaparinux却没有引起副反应，该fondaparinux的平均分子量仅有1.7KD。

早期的研究就发现，肝素的出血作用与其抗凝作用并不相关，因为酶解得到的肝素二糖和四糖没有抗凝活性，却同样在破坏正常的止血机制方面有效，据此，人们提出这样的假说，即肝素和肝素片段可以通过平滑肌细胞表面的受体来干扰肌肉强直性痉挛。平滑肌细胞中钙离子浓度的变化在肌肉收缩中起重要作用，钙离子通过细胞膜上的钙离子通道进出细胞。Shijo(Shinjo S，Ivarne L S，Oliverira V，et.al.Heparin and heparan sulfate disaccharides bind to the exchangerinhibitor peptide region of Na+/Ca2+exchanger and reduce the cytosoliccalcium of smmoth muscle cell lines.J.Biol.Chem.2002，227：48227-48233)等发现只有肝素和硫酸乙酰肝素的二糖可以与Na⁺/Ca²⁺通道相互作用，引起钙离子外泄，从而显著地降低了平滑肌细胞内钙离子浓度(约80％)。肝素二糖和相关寡糖的这一特性可能在治疗心房纤维颤动，心绞痛等方面有应用价值。

肝素二糖还能够抑制NF-(kappa)B细胞激活细胞迁移和调节细胞内信号传导。Hecht等用酶解产生的肝素二糖进行实验，发现三硫酸化二糖能够抑制T-细胞介质的免疫反应，并调节T-细胞、巨噬细胞、肠上皮细胞分泌的肿瘤骨疽因子(TNF-α)、白介素-8(IL-8)、IL-1B。平行实验表明，低硫酸化肝素二糖则没有表现上述生理功能。因此该类化合物的制备也是值得研究的课题。