[发明专利]一种甲烷氧化混合菌的保存方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种甲烷氧化混合菌的保存方法。

背景技术

甲烷氧化菌是自然界中一类特殊的微生物，以甲烷为唯一碳源及能源，广泛存在于泥土、沼泽、稻田、河流、湖泊、森林和海洋中。虽然某些甲烷氧化菌也可以同时利用甲醇，但所有的甲烷氧化菌都不能利用多碳化合物。甲烷氧化菌以其独特的性质和多样的催化功能，在大宗化学品生产、新功能酶开发、瓦斯气体治理以及环境污染物的生物修复方面都具有极大的应用潜力。但甲烷氧化菌纯培养生长极为缓慢，功能不稳定，且甲烷氧化菌纯菌资源较少。而甲烷氧化混合菌是以甲烷氧化菌为主体的不同共生菌体的组合，相比纯菌更有利于工业应用。罗明芳等人研究表明，甲烷氧化混合菌具有高效降解苯酚、高效积累环氧丙烷的能力(罗明芳，等.含有甲烷氧化菌的混合菌群特性研究.微生物学报，2007，47(1)：103～109.)。

在应用混合菌时，其功能的稳定性，取决于菌群结构的稳定性。而在甲烷氧化混合菌的保存方法上，既不能使用纯菌保存常用的平板传代法，也不能采用通常的添加保水性有机物(如甘油等)的菌种冷冻保存方法，因为平板传代过程会丢失混合菌中的大量菌种，而添加保水性有机物很容易引入其他碳源从而改变菌群结构。因此，迫切需要既简便易行，且能有效保持甲烷氧化混合菌的菌群结构和功能的高效保存方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种甲烷氧化混合菌的保存方法。

本发明所提供的甲烷氧化混合菌的保存方法，包括如下步骤：将甲烷氧化混合菌加入NMS培养基中，于密封瓶中2-6℃保存；初始时，所述密封瓶中，NMS培养基、甲烷和空气的体积比为(5-30)∶(5-40)∶(30-80)。

所述保存方法中，初始时，所述密封瓶中，NMS培养基、甲烷和空气的体积比具体可为5∶(2.5-3.5)∶(15-18)。

所述保存方法中，所述甲烷氧化混合菌具体可为处于对数生长期的甲烷氧化混合菌。

所述保存方法中，初始时，所述NMS培养基中所述甲烷氧化混合菌的OD₆₆₀为0.3-1.5，若OD₆₆₀小于0.3则会影响保存效果，增加活化的难度。

所述保存方法中，最好每隔10-60天重新向密封瓶中充入甲烷，使所述密封瓶中，NMS培养基、甲烷和空气的体积比为(5-30)∶(5-40)∶(30-80)。重新充入甲烷后，所述密封瓶中，NMS培养基、甲烷和空气的体积比优选为5∶(2.5-3.5)∶(15-18)。

为保证菌种特性，可定期进行转接活化，转接间隔时间最好不超过一年。

需要使用甲烷氧化混合菌时，直接将保存有所述甲烷氧化混合菌的的培养瓶进行培养即可。

所述甲烷氧化混合菌的制备方法可包括如下步骤：

1)采集煤矿或垃圾填埋场的土样；

2)将步骤1)的土样加入NMS培养基中，于密封瓶中培养；初始时，所述密封瓶中，NMS培养基、甲烷和空气的体积比为(5-30)∶(5-40)∶(30-80)；每24-72小时向密封瓶中置换入甲烷，使所述密封瓶中，NMS培养基、甲烷和空气的体积比为(5-30)∶(5-40)∶(30-80)；

3)每8-12天接种步骤2)的培养液至新的NMS培养基，进行传代；步骤2)的培养液与NMS培养基的体积比为(5-15)∶(95-85)；传至10代以上，得到甲烷氧化混合菌。

所述步骤2)具体可为：初始时，所述密封瓶中，NMS培养基、甲烷和空气的体积比为5∶(2.5-3.5)∶(15-18)；每48小时向密封瓶中置换入甲烷，使所述密封瓶中，NMS培养基、甲烷和空气的体积比为5∶(2.5-3.5)∶(15-18)。

所述步骤3)具体可为：每10天接种步骤2)的培养液至新的NMS培养基，进行传代；步骤2)的培养液与NMS培养基的体积比为10∶90；传至第10代，得到甲烷氧化混合菌。