[发明专利]葡萄糖-6-磷酸脱氢酶及其核苷酸序列、重组载体、重组宿主细胞和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶，编码该酶的核苷酸序列，包括所述核苷酸序列的重组载体，包括所述重组载体的重组宿主细胞，以及包括上述酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。更具体地，本发明涉及一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，编码该葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的核苷酸序列，包括所述核苷酸序列的重组载体，包括所述重组载体的重组宿主细胞，以及包括上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。

背景技术

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH，EC1.1.1.49)是磷酸戊糖途径的关键性调控限速酶，其主要功能是为脂肪酸合成、氮还原和谷胱甘肽等生物分子合成提供还原力NADPH或NADH，也为核酸合成提供戊糖。其具体催化的反应可以如以下的式一或式二所示：

(式一)

(式二)

由以上反应式可知，可以通过在340nm波长处监测NADPH或NADH的生成速率来测定葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活。

因而可以制备成包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的相应试剂盒，例如检测肌酸激酶的试剂盒。以检测肌酸激酶的试剂盒为例，其原理可以是在肌酸激酶的作用下，肌酸磷酸与ADP反应生成ATP和肌酸。在己糖激酶催化下，葡萄糖与ATP反应生成葡萄糖-6-磷酸和ADP。在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的催化下，葡萄糖-6-磷酸与NADP⁺反应生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH，NADPH在340nm处有最大吸收，通过测定NADPH生成速率来计算肌酸激酶活性。

但是目前的试剂盒所用的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶存在着耐热性差(参见图1)，使试剂盒的运输、保存和使用过程对环境温度要求较高，容易由于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的变性而影响到试剂盒测定的有效性和准确性。例如，JP2001-037480中公开了一系列葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的变异体，它们在52℃的温度下在pH为6.7的咪唑醋酸缓冲液中60分钟的酶活稳定性都出现显著下降(参见该专利的图2)。此外，目前的试剂盒所用的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶只能在窄的pH值范围内保持较高的稳定性(参见图3)，大大局限了试剂盒能够测定的被测标本的范围，对测定的pH条件要求较高，从而对使用试剂盒的人员的操作技术水平要求也很高。

发明内容

本发明的一个目的是克服现有的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶耐热性差、仅能在窄的pH值范围内保持较高的稳定性的缺点，提供一种耐热性好、能在宽的pH值范围内保持较高的稳定性，并且反复冻融后残留酶活性高的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。

本发明的第二个目的是提供编码所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的核苷酸序列。

本发明的第三个目的是提供包括所述核苷酸序列的重组载体。

本发明的第四个目的是提供包括所述重组载体的重组宿主细胞。

本发明的第五个目的是提供包括上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。

本发明的发明人付出了大量地创造性劳动，对假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291)的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶序列进行随机定点突变，得到本发明具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。并且本发明的发明人意外地发现，所得葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、能在宽的pH值范围内保持较高的稳定性，并且具有反复冻融后残留酶活性高的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。

本发明提供了一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，其中，所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

本发明还提供了编码本发明所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的核苷酸序列。

本发明还提供了包括本发明所述核苷酸序列的重组载体。

本发明还提供了包括本发明所述重组载体的重组宿主细胞。

本发明还提供了包括本发明所述的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。

本发明提供的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶具有如下优点：

第一，耐热性好。参见图1可知，本发明的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在52℃加热60分钟后都具有90％以上的相对活性，明显高于在相同条件下的对比例1的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的相对活性。