[发明专利]一种固态发酵制备嘌呤核苷磷酸化酶的方法

权利要求书

1.一种固态发酵枯草芽孢杆菌以制备嘌呤核苷磷酸化酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)制备玉米芯固体基质

将无霉变玉米芯粉碎后过20目筛收集筛下物，然后将所收集的筛下物过40目筛收集筛上物，得到20-40目颗粒直径的玉米芯固体基质；

使所得玉米芯固体基质水分含量达30％；

116-120℃灭菌60分钟；

2)配制培养基的液体部分

按照以下组分含量表配制培养基的液体部分：

蛋白胨    5-50        酵母粉    2-50

蔗糖      0.5-5.0     碳酸钙    5-100

肌苷      5-10        硫酸铵    1.0-4.0

磷酸氢二钠1.0-3.0     磷酸二氢钾1.0-3.0

七水硫酸镁0.05-0.1    pH        5.0-7.5

其中，溶剂为水，单位为每升水中含有的克数，

配制好的液体部分在116℃下灭菌20分钟；

3)制备固体培养基并接种枯草芽孢杆菌种子液

在无菌条件下，将以下a)、b)和c)混合：

a)已经冷却至枯草芽孢杆菌能存活的温度的步骤1)得到的固体基质，

b)已经冷却至枯草芽孢杆菌能存活的温度的步骤2)得到的液体部分，

c)细胞密度为10⁵-10⁸个/ml的枯草芽孢杆菌种子液，

其中，a)和b)的重量比范围为1∶1.7至1∶2.2，c)占a)与b)之和的5-10％；

所得混合物以1-5厘米的厚度，在温度为25-36℃、湿度为70-90％、氧气浓度为环境空气中氧气浓度的1-2倍的条件下发酵15-24小时；

4)分离玉米芯固体基质

i)将步骤3)得到的发酵产物与浸提液按照1∶2.5至1∶3.0的重量比混合，浸提20-60分钟，然后搅拌至形成均匀分散体，其中，所述浸提液为含1％氯化钠的pH 7.6的0.1M的磷酸钾缓冲液；

ii)将步骤i)所得均匀分散体通过40目不锈钢滤网过滤，分别收集滤液和滤渣；

iii)将步骤ii)所收集滤液在8000G下离心25分钟，分别收集上清液和细胞沉淀；

iv)取步骤iii)所收集的上清液与步骤ii)所述滤渣，重复上述步骤i)至步骤iii)三次，

v)用pH 7.6的0.1M的磷酸钾缓冲液重悬步骤iii)和步骤iv)得到的细胞沉淀，并合所得细胞重悬液，其中，所述pH 7.6的0.1M的磷酸钾缓冲液与步骤3)得到的发酵产物的重量比为1∶1至1∶3；

5)破碎细胞

将步骤4)得到的细胞重悬液用高压匀浆机在60-85兆帕的条件下匀浆，所得匀浆液在8000G下离心15分钟，收集上清即粗酶液；

6)酶的纯化

对步骤5)得到的粗酶液进行以下A)和/或B)的操作：

A)在50-60℃下热处理10-50分钟；

B)加入硫酸铵使其终浓度达10-20％静置1-4小时，在8000G下离心20-30分钟，收集上清，弃去沉淀；在所收集的上清中继续加入硫酸铵使其终浓度达25-40％静置1-4小时，在8000G下离心20-30分钟，弃去上清，收集沉淀；

其中，

I)单独进行A)操作后，将所得悬浮液在15000G下离心25-30分钟，收集上清，弃去沉淀；

II)单独进行B)操作后，将所得沉淀用1-3倍体积的、pH值为7.5的100mM的Tris-HCl缓冲液复溶；

III)先完成A)操作时，将所得悬浮液在15000G下离心25-30分钟，收集上清，弃去沉淀；然后进行B)操作，最后将所得沉淀用1-3倍体积的、pH值为7.5的100mM的Tris-HCl缓冲液复溶；或者

IV)先完成B)操作时，将所得沉淀用1-3倍体积的、pH值为7.5的100mM的Tris-HCl缓冲液复溶；然后进行A)操作，最后将所得悬浮液在15000G下离心25-30分钟，收集上清，弃去沉淀；

7)酶液的脱盐

将上述步骤6)中I)或IV)最终收集的上清或者II)或III)得到的重悬液用孔径为0.22-0.8μm的滤膜过滤，收集滤液在4℃下保存；

葡聚糖凝胶G-25脱盐柱经pH值为7.5的50mM的Tris-HCl缓冲液过夜平衡后，用线性流速1.9厘米/分钟的速度将上样所述4℃下保存的保存滤液，并用pH值为7.5的50mM的Tris-HCl缓冲液以2.8厘米/分钟的速度洗脱，收集吸收波长在280nm处的蛋白单峰，合并吸收值在20％峰高以上的组分；

8)酶的冻干

将步骤7)收集到的组分加入甘露醇至其终浓度达0.5％，在零下35℃到零下40℃之间冷冻升华干燥至恒重即得嘌呤核苷磷酸化酶干粉。