[发明专利]一种固态发酵制备嘌呤核苷磷酸化酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种固态发酵制备酶的方法，更具体地，本发明涉及一种固态发酵制备嘌呤核苷磷酸化酶的方法。

背景技术

嘌呤核苷磷酸化酶(Purine Nucleoside Phosphorylase，PNP，酶学分类号为EC 2.4.2.1)催化如下反应：

其中，肌苷是血清腺苷脱氨酶和5’-核苷酸酶所催化反应的重要产物，因此嘌呤核苷磷酸化酶可用于测定与肝胆疾病相关的血清腺苷脱氨酶和5’-核苷酸酶活性的临床生化诊断试剂盒。

现有的嘌呤核苷磷酸化酶一般通过液体发酵枯草芽孢杆菌获得。例如CN101289646中公开了通过液体发酵中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心编号为10741的枯草芽孢杆菌(ACCC10741)获得嘌呤核苷磷酸化酶的方法。其中，为保证该好氧性枯草芽孢杆菌ACCC10741在发酵过程中能够充分得与氧气接触，需要使用发酵罐、空气压缩机以及空气过滤设备来保证2.0m³/h的通气量。

因此现有的液体发酵枯草芽孢杆菌制备嘌呤核苷磷酸化酶的方法，对设备和操作技术要求苛刻，存在耗能多、耗时长，并且所得到的嘌呤核苷磷酸化酶产品活性仍有待提高的缺陷。

发明内容

本发明的目的是克服现有的液体发酵枯草芽孢杆菌制备嘌呤核苷磷酸化酶的方法，对设备和操作技术要求苛刻，存在耗能多、耗时长，并且所得到的嘌呤核苷磷酸化酶产品活性仍有待提高的缺点，提供一种耗能少，耗时少，得到的嘌呤核苷磷酸化酶产品活性高的固态发酵制备嘌呤核苷磷酸化酶。

现有技术一般认为液态发酵枯草芽孢杆菌较固态发酵枯草芽孢杆菌更易从中分离嘌呤核苷磷酸化酶产品，因此能够更高效并以更简单的工艺来生产的嘌呤核苷磷酸化酶。本发明的发明人克服了现有技术的上述偏见，大胆地使用固态发酵枯草芽孢杆菌来制备嘌呤核苷磷酸化酶产品，并且采用颗粒直径为20-40目、含水量30％的无霉变玉米芯灭菌后作为固态发酵培养基的固体基质，结合独特的工艺，不仅没有出现分离困难的问题，而且以更低的设备要求、更小的能耗、高效地实现了高活性嘌呤核苷磷酸化酶的生产。

本发明提供了一种固态发酵枯草芽孢杆菌以制备嘌呤核苷磷酸化酶的方法，其中，所述方法包括以下步骤：

1)制备玉米芯固体基质

将无霉变玉米芯粉碎后过20目筛收集筛下物，然后将所收集的筛下物过40目筛收集筛上物，得到20-40目颗粒直径的玉米芯固体基质；

使所得玉米芯固体基质水分含量达30重量％；

116-120℃灭菌60分钟；

2)配制培养基的液体部分

按照以下组分含量表配制培养基的液体部分：

蛋白胨        5-50        酵母粉        2-50

蔗糖          0.5-5.0     碳酸钙        5-100

肌苷          5-10        硫酸铵        1.0-4.0

磷酸氢二钠    1.0-3.0     磷酸二氢钾    1.0-3.0

七水硫酸镁    0.05-0.1    pH            5.0-7.5

其中，溶剂为水，单位为每升水中含有的克数，

配制好的液体部分在116℃下灭菌20分钟；

3)制备固体培养基并接种枯草芽孢杆菌种子液

在无菌条件下，将以下a)、b)和c)混合：

a)已经冷却至枯草芽孢杆菌能存活的温度的步骤1)得到的固体基质，

b)已经冷却至枯草芽孢杆菌能存活的温度的步骤2)得到的液体部分，

c)细胞密度为10⁵-10⁸个/ml的枯草芽孢杆菌种子液，

其中，a)和b)的重量比范围为1∶1.7至1∶2.2，c)占a)与b)之和的5-10重量％；

所得混合物以1-5厘米的厚度，在温度为25-36℃、湿度为70-90％、氧气浓度为环境空气中氧气浓度的1-2倍的条件下发酵15-24小时；

4)分离玉米芯固体基质

i)将步骤3)得到的发酵产物与浸提液按照1∶2.5至1∶3.0的重量比混合，浸提20-60分钟，然后搅拌至形成均匀分散体，其中，所述浸提液为含1％氯化钠的pH 7.6的0.1M的磷酸钾缓冲液；

ii)将步骤i)所得均匀分散体通过40目不锈钢滤网过滤，分别收集滤液和滤渣；