[发明专利]蔗糖密度梯度紫外光定量法检测口蹄疫抗原146S含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种定量检测口蹄疫抗原146S含量的方法，具体来讲，涉及蔗糖密度梯度紫外光定量法检测口蹄疫抗原146S含量的方法。

背景技术

目前已经应用或有报道的口蹄疫抗原定量检测技术主要有：1.乳鼠半数致死量(LD50)测定口蹄疫病毒抗原含量，例如，选取2～3日龄乳鼠，将口蹄疫病毒抗原做10倍系列稀释，每个滴度按每只0.2ml的量颈背部皮下注射4只乳鼠，根据乳鼠发病死亡情况最终计算出病毒抗原含量；2.细胞半数感染量(TCID50)测定口蹄疫病毒抗原含量，例如，将病毒在96孔平底培养板上作10倍连续稀释，每孔病毒液的量为50ml，再加入100ml细胞悬液，置于37℃、5％的二氧化碳温箱中培养，72小时根据细胞病变情况计算病毒抗原含量；3.补体结合试验(CFT)定量口蹄疫病毒抗原含量，其原理是根据病毒抗原与血清抗体发生特异反应形成复合物时，加入的补体因子结合于该复合物而被消耗，溶血系统中没有游离补体将不发生溶血，试验显示阳性，将病毒做适当的连续稀释，根据最终阳性显示结果从而定量病毒抗原含量；4.间接夹心ELISA检测口蹄疫病毒抗原含量，即将口蹄疫病毒抗原做连续系列稀释，加入已包被口蹄疫特异性多克隆捕获抗体的ELISA板孔中，被捕获的抗原又与随后加入的特异性多克隆检测抗体反应，形成夹心式结合，通过酶促反应系统显色情况，结合已得出的线性回归方程计算出被检测病毒抗原的含量；5.单克隆抗体夹心ELISA定量口蹄疫完整病毒粒子，即筛选出针对口蹄疫病毒146S特异位点的单克隆抗体包被ELISA板，加入被检测的病毒抗原，随后再加入针对146S特异位点的单克隆抗体的酶促反应系统，根据最后的显色情况，应用图解法定量病毒抗原的146S含量。口蹄疫抗原146S是口蹄疫疫苗最主要的抗原成分，口蹄疫抗原146S的含量反映了口蹄疫疫苗的质量。方法1和方法2是对病毒核酸进行检测，不仅能测定完整病毒粒子的核酸，还能测定146S裂解产物的核酸，不能反应病毒的免疫原；方法3由于受到前补体和抗补体因子的干扰，检测的准确性与敏感性均受到制约，而且也不能很好的区分12S和146S；方法4存在的主要问题也是不能很好的区分12S和146S；方法5虽能够很好的区分12S和146S，但对不同型的病毒，该方法必须筛选出各自的单克隆抗体，建立各自独立的ELISA检测和计算系统。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有较好的重复性和适用性，可用于各种口蹄疫病毒146S含量的准确定量测定的方法。

基于上述目的，本发明提供了蔗糖密度梯度紫外光定量法检测口蹄疫抗原146S含量的方法，包括以下步骤：

(1)预处理病毒液除去杂蛋白；

(2)超速离心病毒液，用PBS液重悬至原体积的1/8～1/12，得到病毒浓缩液，置于2～8℃冰箱中备用；

(3)制备15％～45％均匀线性蔗糖梯度；

(4)利用制备的15％～45％均匀线性蔗糖梯度对所述病毒浓缩液进行蔗糖密度梯度超速离心；

(5)弃掉梯度顶部1～2ml液体，将连接在连续流紫外分光光度计流动样品池上进样端的长针头缓慢插入待检各管样品的管底，按照连续流紫外分光光度计的操作程序，对每管样品泵入流动样品池的各个级份进行连续不间断测定OD_259nm值；

(6)计算被检测样品OD值峰面积，根据下列公式：

FR×PA×FSD×1000S×PL×E×W]]>

计算出病毒液中146S的含量，其中：FR是蔗糖通过样品池的流速，这可以通过联接分光光度计的电脑在其软件系统中自行设定；PA是OD值峰面积，是紫外分光光度计对样品OD值连续扫描所形成曲线的峰面积；S是紫外分光光度计对样品OD值连续扫描的速度；FSD是紫外分光光度计吸光度单位，可自行选择设定；PL是紫外分光光度计所使用流动样品池的光程长度，可以选择0.1cm，0.2cm，0.5cm，1cm；W是加在梯度上的样品原始重量或体积；E为校正系数，为任选的正数。