[发明专利]悬浮细胞蚀斑滴定口蹄疫病毒的方法

权利要求书

1.悬浮细胞蚀斑滴定口蹄疫病毒的方法，包括以下步骤：

(1)将琼脂糖生理盐水溶液与无血清培养基按照0.9～1.1∶1的体积比混匀，得到琼脂溶液， 其中，琼脂糖生理盐水溶液含有1.9～2.1重量％的琼脂糖和0.85～0.9重量％的盐；

(2)将所述琼脂溶液加至细胞培养板中，晃动细胞培养板，使所述琼脂溶液铺满细胞培养 板底层，得底层琼脂培养板，置于平坦的位置，冷却、凝固；

(3)BHK-21悬浮培养细胞，800～1000rpm离心5～8分钟，得到浓缩细胞，用无血清培养 基稀释浓缩细胞得到细胞悬液，细胞密度为0.6×10⁷～1.0×10⁷个/毫升；

(4)10⁶～10⁷倍稀释待测定的口蹄疫毒液，得到梯度浓度口蹄疫毒液；

(5)分别将9～11体积份的各梯度浓度口蹄疫毒液和9～11体积份的对照液都与39～41体积 份的所述细胞悬液和48～52体积份的琼脂糖生理盐水混合，得到含有各梯度浓度口蹄疫病毒 的上层琼脂溶液和对照用的上层琼脂溶液，其中，琼脂糖生理盐水溶液含有1.9～2.1重量％的 琼脂糖和0.85～0.9重量％的盐；

(6)分别将所述含有各梯度浓度口蹄疫病毒的上层琼脂溶液和对照用的上层琼脂溶液加 入到步骤(2)得到的底层琼脂培养板的各培养孔中，凝固后用封口膜封口，倒置于CO₂培养箱 中培养24～48小时，得到蚀斑计数板；

(7)向蚀斑计数板内加入0.02～0.03重量％的中性红染色液，作用10～30分钟后，移去中性 红染色液，对着灯光观察蚀斑计数板的各培养孔的蚀斑数；

(8)含有对照用的上层琼脂溶液的培养孔无蚀斑出现的蚀斑计数板为有效板，根据有效板 的各培养孔的蚀斑数、接种的待测定的口蹄疫病毒液的用量及稀释倍数计算出待测定的口蹄 疫病毒液的毒价，待测定的口蹄疫病毒液的毒价的计算公式为

所述最适稀释倍数是指蚀斑数清晰可辨的稀释倍数。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，无血清培养基为BBSM培养基。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，琼脂糖生理盐水溶液中的盐为氯化钠。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞培养板为六孔板。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，CO₂培养箱的CO₂体积含量 为4～6％，温度为36～37℃。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述最适稀释倍数为使蚀斑数达到8～20 个的稀释倍数。