[发明专利]悬浮细胞蚀斑滴定口蹄疫病毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种口蹄疫病毒(FMDV)毒价测定方法，具体地讲，涉及一种口蹄疫病毒 悬浮细胞蚀斑测毒方法。

背景技术

目前，口蹄疫病毒毒价的测定方法普遍采用细胞半数感染量(TCID50)和乳鼠半数致死 量(LD50)这两种方法。LD50方法需要用到活体动物，活体动物的个体差异将会给检测结 果带来很大的影响。TCID50方法需要提前制备单层细胞，而且需要在实验过程中添加血清， 这使得检测的进程受到细胞生长状态的限制，同时检测结果也会受到所添加血清的影响。

另外，悬浮细胞蚀斑测定也是病毒毒价的一种有效测定方法。病毒感染细胞后，通过固 体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向周边扩展。经过几个增殖周期，便形成 一个局限性病变细胞区，此即病毒蚀斑。从理论上讲，一个蚀斑是由最初感染细胞的一个病 毒颗粒形成的，因而可通过病毒颗粒计数测定毒价。通常用琼脂等固相介质防止释放的病毒 在介质中流动，以便将蚀斑控制在适宜的范围内。为便于肉眼观察，常用中性红等染料染色。 因病变细胞不吸收中性红，病变细胞区便呈现无色蚀斑。病毒悬液的滴度可以以每毫升蚀斑 形成单位(PFU/ml)来表示。在实际操作中，需要配制合适的介质，有效地控制接种条件和 反应条件才能获得可靠的测定结果。目前，还没有准确有效的口蹄疫病毒蚀斑测毒方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种准确的标准化口蹄疫病毒毒价测定方法，以克服现有的口蹄疫 病毒毒价测定方法受到活体动物个体差异等因素影响而带来的检测误差较大的问题。

本发明提供的口蹄疫病毒毒价测定方法为口蹄疫病毒悬浮细胞蚀斑测毒方法，包括以下 步骤：

(1)将琼脂糖生理盐水溶液与无血清培养基按照0.9～1.1∶1的体积比混匀，得到琼脂溶液， 其中，琼脂糖生理盐水溶液含有1.9～2.1重量％的琼脂糖和0.85～0.9重量％的盐；

(2)将所述琼脂溶液加至细胞培养板中，晃动细胞培养板，使所述琼脂溶液铺满细胞培养 板底层，得底层琼脂培养板，置于平坦的位置，冷却、凝固；

(3)BHK-21悬浮培养细胞，800～1000rpm离心3～5分钟，得到浓缩细胞，用无血清培养 基稀释浓缩细胞得到细胞悬液，细胞密度为0.6×10⁷～1.0×10⁷个/毫升；

(4)10⁶～10⁷倍稀释待测定的口蹄疫毒液，得到梯度浓度口蹄疫毒液；

(5)分别将9～11体积份的各梯度浓度口蹄疫毒液和9～11体积份的对照液都与39～41体积 份的所述细胞悬液和48～52体积份的琼脂糖生理盐水混合，得到含有各梯度浓度口蹄疫病毒 的上层琼脂溶液和对照用的上层琼脂溶液，其中，琼脂糖生理盐水溶液含有1.9～2.1重量％的 琼脂糖和0.85～0.9重量％的盐；

(6)分别将所述含有各梯度浓度口蹄疫病毒的上层琼脂溶液和对照用的上层琼脂溶液加 入到步骤(2)得到的底层琼脂培养板的各培养孔中，凝固后用封口膜封口，倒置于CO₂培养箱 中培养24～48小时，得到蚀斑计数板；

(7)向蚀斑计数板内加入0.02～0.03重量％的中性红染色液，作用10～30分钟后，移去中性 红染色液，对着灯光观察蚀斑计数板的各培养孔的蚀斑数；

(8)含有对照用的上层琼脂溶液的培养孔无蚀斑出现的蚀斑计数板为有效板，根据有效板 的各培养孔的蚀斑数、接种的待测定的口蹄疫病毒液的用量及稀释倍数计算出待测定的口蹄 疫病毒液的毒价。

无血清培养基较佳为BBSM培养基。例如为清大天一公司生产的BBSM培养基，按其说 明书配制。

琼脂糖生理盐水溶液中的盐可以为氯化钠。

所述细胞培养板可以为六孔板。

较佳地，CO₂培养箱的CO₂体积含量为4～6％，温度为35～37℃。

较佳地，步骤(8)中，待测定的口蹄疫病毒液的毒

价的计算公式为

所述最适稀释倍数是指蚀斑数清晰可辨的稀释倍数。

较佳地，所述最适稀释倍数为蚀斑数在8～20个范围的稀释倍数。