[发明专利]非病毒载体及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于高分子化学和生物医学工程领域，涉及一种非病毒载体及其制备方法与应用。

背景技术

肿瘤是基因病，肿瘤发生的遗传背景是癌基因或抑癌基因的异常，基因治疗是对肿瘤细胞或正常细胞转移一个或几个正常基因，它的表达产物有利于直接或间接的杀伤肿瘤细胞；或保护正常细胞免受化疗与放疗的严重伤害，但是传统的基因导入系统存在的问题在于：(1)缺乏靶向性，而且具有较高的细胞毒性和免疫原性，如以携带p53基因的腺病毒治疗恶性肿瘤的方案中，只能直接将腺病毒注射到肿瘤局部。若静脉注射，病毒颗粒将很快被清除，真正能够到达肿瘤组织的目的基因很少，难以达到治疗效果，且增加了副作用；(2)存在安全性问题，目前针对遗传性疾病的基因治疗方案大多采用逆转录病毒载体，其插入或整合到染色体的位置是随机的，有引起插入突变及细胞恶性转化的潜在危险。(3)转染和表达效率低，质粒载体因为含有CpG序列，进入细胞后能够被机体沉默而不能持续高效的表达。

非病毒载体作为肿瘤基因治疗的载体优势在于具有较高的安全性和较低的免疫原性，并且由于肿瘤血管表皮的特殊构造，能够被动靶向肿瘤组织，目前主要应用的非病毒载体有脂质体，多聚阳离子，树枝状高分子等，非病毒载体与DNA一般通过电荷的相互作用形成聚阳离子复合物，由于聚阳离子复合物对细胞的毒性较大，容易形成肺部栓塞，并且与蛋白非特异性结合，如静脉注射，不容易到达靶器官等。为减少聚阳离子的细胞毒性和增加聚阳离子复合物的生物相溶性，可以对高分化合物进行相应的修饰，如PEG的修饰等。

由于遗传物质的变异，在一些肿瘤细胞表面高表达叶酸受体分子，叶酸受体是一个特异的抗肿瘤药物传送靶位，在大部分来源于上皮组织的恶性肿瘤如卵巢癌，子宫内膜癌，肾癌，乳腺癌，肺癌，结肠癌和鼻炎癌中均有高度表达，特别是妇科肿瘤，90％的卵巢癌细胞系都有叶酸受体的高度表达，而叶酸受体在正常组织中缺失或只在极化上皮细胞的顶点表达，所以叶酸在正常组织中通常不会积累。

因为叶酸与叶酸受体具有高亲和力，并且叶酸分子自身稳定性高，免疫原性低，与纳米有机材料相容性好，是肿瘤靶标的理想配体。

FA-PEG-PEI纳米材料是一种理想的肿瘤靶向纳米材料。之前人们应用的FA-PEG-PEI材料在细胞水平取得良好的效果，但是在动物体内通过系统注射时发现在质粒浓度高的情况下形成的纳米颗粒容易发生聚沉，注射后容易导致肺部血管栓塞而致动物死亡，由于颗粒的聚沉导致注射后不能很好的透过肿瘤血管内皮，进而不能有效靶向肿瘤器官。叶酸配体在材料表面的丰度对材料在肿瘤部位的聚集具有一定的影响，所以选取合适的叶酸接枝率有利于提高纳米颗粒在肿瘤部位的富集。

研究表明，外源基因表达盒与细菌质粒骨架之间的共价连接会导致外源基因的沉默，这是造成质粒载体所携带的外源基因在体内只能瞬时表达的主要原因，也是质粒载体临床应用的主要限制因素。小环DNA(minicircleDNA)载体是一种自1997年发展起来的新型的基因载体，与常用的非病毒载体质粒载体相比，小环DNA载体仅由外源基因的表达盒构成，不含有来自细菌质粒的骨架结构。因为它仅由外源基因的表达盒构成，不含来自细菌质粒的骨架结构，从而减少了CpG模序甲基化所致的免疫反应，提高了安全性；而且更有效的提高了转基因的表达和生物利用度。

发明内容

本发明的目的是提供一种非病毒载体和非病毒载体及其制备方法与应用。

本发明提供的非病毒载体，是聚乙烯亚胺与式V所示化合物共混而得的纳米颗粒。

其中，m＝145，n为小于m的正整数；式V所述化合物的相对数均分子量为20600，分子量分布为1.73。

该非病毒载体中，所述纳米颗粒的粒径为70-90纳米；所述聚乙烯亚胺与式V所示化合物的摩尔比为10-15∶85-90；所述聚乙烯亚胺的分子量为25kDa；共混的温度为20-30℃，共混的时间为15-20分钟。

本发明提供的制备上述非病毒载体的方法，包括如下步骤：将聚乙烯亚胺与式V所示化合物进行共混，得到上述非病毒载体。

该方法中，所述聚乙烯亚胺与式V所示化合物的摩尔比为10-15∶85-90；所述聚乙烯亚胺的分子量为25kDa；共混的温度为20-30℃，共混的时间为15-20分钟。

本发明还提供了一种药物，其中，该药物的载体是上述本发明提供的非病毒载体。