[发明专利]一种5-磷酸木酮糖的制备方法有效
| 申请号： | 200910093090.2 | 申请日： | 2009-09-21 |
| 公开（公告）号： | CN101665815A | 公开（公告）日： | 2010-03-10 |
| 发明（设计）人： | 李荣杰;徐斌;薛培俭;付松 | 申请（专利权）人： | 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 |
| 主分类号： | C12P19/02 | 分类号： | C12P19/02;C12R1/01;C12R1/64;C12R1/19;C12R1/725;C12R1/865 |
| 代理公司： | 北京路浩知识产权代理有限公司 | 代理人： | 王朋飞 |
| 地址： | 233010*** | 国省代码： | 安徽;34 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 磷酸 木酮糖 制备 方法 | ||
1.一种5-磷酸木酮糖的制备方法，其特征在于，在大肠杆菌中 过量表达带有6个组氨酸标签的木酮糖激酶基因，然后在树脂层析柱 中通过组氨酸标签与层析柱的特异性结合，对表达的木酮糖激酶进行 分离纯化，同时固定化木酮糖激酶，最后加入底物木酮糖和三磷酸腺 苷，将体系加热至70-85℃，保温2h，合成5-磷酸木酮糖；所述的木酮 糖激酶基因来源于嗜热厌氧乙醇菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于其中所述木酮糖 激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码该木酮糖激酶的基因序 列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于分离纯化包括步 骤：1)以NTA介质填柱，用2倍柱体积的去离子水洗涤，接着加NiSO4溶液至NTA介质结合度达到饱和，用5倍柱体积的NAT-0缓冲液洗柱， NAT-0缓冲液为20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl；2)将含有过表 达的木酮糖激酶的大肠杆菌破碎菌体离心后得到的上清加入到 Ni2+-NTA树脂柱中，反复加入2～3次后，用5倍柱体积的NAT-1缓冲液 洗涤介质以去除杂蛋白，NAT-1缓冲液为含有80mmol/L咪唑的NAT-0 缓冲液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于加入底物木酮 糖和三磷酸腺苷的体系为：D-木酮糖：重量百分比为1％，CoCl2·6H2O： 2×10-4mol/L，ATP：0.5mol/L，MgSO4·7H2O：2×10-3mol/L，pH 8.0。
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