[发明专利]一种5-磷酸木酮糖的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种5-磷酸木酮糖的制备方法，具体地说，涉及一种 利用基因工程技术和固定化酶技术制备5-磷酸木酮糖的方法。

背景技术

木糖是半纤维素的主要组成成分，在植物纤维材料水解液中占 30％左右，是仅次于葡萄糖的自然界最丰富的糖分。利用微生物工程 发酵转化木糖生产乙醇是当前的研究热点之一。

自然界存在某些天然利用木糖的微生物，包括细菌、酵母和丝状 真菌。真菌和细菌的代谢木糖的方式不尽相同，但都必需利用PP途径。 酵母及丝状真菌的木糖代谢方式是经一系列酶(木糖还原酶、木糖醇 脱氢酶和木酮糖激酶)作用将木糖转化为D-木酮糖-5-磷酸，进入PP途 径，然后再进行其它代谢。细菌的木糖代谢途径也是经一系列酶(木糖 异构酶、木酮糖激酶)的作用下将木糖转化为D-木酮糖-5-磷酸，进入PP 途径，然后再进行其它代谢。

5-磷酸木酮糖是木糖代谢的中间产物，也是研究木糖代谢途径中 重要转化酶—转酮酶的底物，也是研究肝脏组织糖代谢途径的重要物 质。目前获得5-磷酸木酮糖的方法为天然提取法，方法繁琐，并且得 率低。

本发明在此背景下，为了克服目前制备工艺的不足，利用基因工 程表达技术和木酮糖激酶固定化酶技术制备5-磷酸木酮糖，简化了制 备工艺，并提高了得率。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用基因工程技术和固定化酶技术制 备5-磷酸木酮糖的方法。

本发明的目的是采用以下的技术方案来实现的。依据本发明提供 的一种5-磷酸木酮糖的制备方法，在大肠杆菌中过量表达带有6个组 氨酸标签的木酮糖激酶基因，然后在树脂层析柱中通过组氨酸标签与 层析柱的特异性结合，对表达的木酮糖激酶进行分离纯化，同时固定 化木酮糖激酶，最后加入底物木酮糖和三磷酸腺苷，合成5-磷酸木酮 糖。

本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。

本发明涉及的木酮糖激酶基因来源于嗜热厌氧乙醇菌 (Thermoanaerobacter ethanolicus)，但也包括含有木酮糖激酶的其它微 生物，如野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、大肠杆菌 (Escherichia coli)、白热带假丝酵母(Candida albicans)、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、移动发酵单胞菌(Zymomonos mobilis) 等。

前述的制备方法，其中所述的木酮糖激酶基因优选来源于嗜热厌 氧乙醇菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)。

前述的制备方法，其中所述木酮糖激酶具有SEQ ID NO.1所示的 基因序列和SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。由其编码表达的木酮糖 激酶具有耐热性，可耐80℃以上的高温。从而后一步的合成反应可较 高效的进行，并且降低了染杂菌的风险。

前述的制备方法，采用亲和层析法分离纯化表达产物。

前述的制备方法，其中所述分离纯化包括步骤：1)以NTA介质 填柱，用2倍柱体积的去离子水洗涤，接着加NiSO₄溶液至NTA介质结 合度达到饱和，用5倍柱体积的NAT-0缓冲液(20mM Tris-HCl pH7.9， 0.5M NaCl)洗柱；2)将含有过表达的木酮糖激酶的大肠杆菌破碎菌 体离心后得到的上清加入到Ni²⁺-NTA树脂柱中，反复加入2～3次后， 用5倍柱体积的NAT-1缓冲液(即NAT-0缓冲液含有80mmol/L咪唑) 洗涤介质以去除杂蛋白。

前述的制备方法，其中按上述方法洗去杂蛋白后，在Ni²⁺-NTA 树脂柱中保留带有6个组氨酸标签的木酮糖激酶，将含有木酮糖和三 磷酸腺苷的体系加热至70-85℃，反应体系在螯合有His-tag-XK的 Ni²⁺-NTA树脂柱中保温2h，得到含有木酮糖和5-磷酸木酮糖的反应 体系，利用液相色谱技术分离纯化5-木酮糖。