[发明专利]一种光滑球拟酵母突变株及其在发酵生产丙酮酸中的应用

说明书

技术领域

本发明属于发酵工程领域，特别是涉及一种光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)CGMCCNo.3077发酵生产丙酮酸的方法。

背景技术

丙酮酸，是一种用途非常广泛的有机酸，可用于多种有用化合物的合成前体。在医药工业中，丙酮酸作为L-色氨酸、L-酪氨酸、L-多巴、L-半胱氨酸、L-亮氨酸、维生素B₆和B₁₂等酶法合成过程的主要原料；在农药方面，用作阿托酸、谷物保护剂等多种农药的起始原料；在食品和日化行业，可作为酸味添加剂、特效减肥剂(丙酮酸钙)以及化妆品抗氧化剂。丙酮酸还广泛应用作生物技术诊断试剂、检测试剂，可用于伯醇及仲醇的检定、生化研究转氨酶的测定，以及脂肪族胺的显色剂。此外，丙酮酸也是动物细胞培养的重要底物。因此，丙酮酸在化工、制药和农用化学品等工业及科学研究中有着广泛的用途和广阔应用前景。

目前，工业化生产丙酮酸的方法有酒石酸脱水脱羧法、乳酸乙酯氧化法、直接发酵法等。酒石酸脱水脱羧法合成丙酮酸是早期工业化应用的方法，存在丙酮酸产率较低、成本高、污染严重等缺点，是目前国内外工业化生产普遍采用方法。乳酸乙酯氧化法合成丙酮酸是以乳酸为原料经过多步转化而得，但此工艺流程步骤多、损失大、副产物多，国内温州柳城集团澳昆化工有限公司已经开始应用此法生产丙酮酸。以葡萄糖等糖质为原料直接发酵合成丙酮酸具有污染少、产品质量高等优点，是一种理想的生物合成工艺路线，成为研究的热点。现今，直接发酵生产丙酮酸在国外(如日本)已实现工业化，我国新疆天富生化技术有限公司采用发酵法生产丙酮酸，物理萃取的提取工艺。至今有多篇有关丙酮酸发酵的专利，尽管其产量和转化率较高，但是并未有其提取后目的产物的验证。本发明发酵生产丙酮酸尽管其产量和转化率稍低，但提取工艺简单，收率高，有应用前景。

发明内容

本发明目的是提供一种光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)突变株及其在发酵生产丙酮酸中的应用。该菌株于2009年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，中国，北京，保藏号为CGMCC No.3077。

光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)突变株CGMCC No.3077是以光滑球拟酵母(Torulopsisglabrata)NBRC 0005菌株为出发菌株，经紫外线诱变，突变株初筛，三角瓶发酵复筛，最后确定的光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)突变株。该菌株的个体形态特征为圆形或卵圆形，液体培养的个体比固体培养的个体稍大，繁殖方式为出芽生殖；群体形态特征为：对数期颜色为白色，菌落衰老期为灰白色；边缘整齐；表面光滑；湿润；粘稠；易从培养基上挑起。其生理生化特征为能够发酵葡萄糖、蔗糖和麦芽糖等糖质原料，能够快速发酵葡萄糖生成丙酮酸。

利用本发明提供的光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)突变株CGMCC No.3077发酵生产丙酮酸，其特征在于：

1)种子培养：将菌种转接到液体培养基中，其中葡萄糖质量百分比为2％，蛋白胨质量百分比2％，酵母粉质量百分比1％，琼脂质量百分比2％，培养温度29℃，培养24小时；

2)摇瓶发酵：无菌操作，按10％的接种量将培养好的种子接种于100ml液体发酵培养基中，液体发酵培养基中含有糖质质量百分比为15％～20％，氮源质量百分比为1.0％～3.0％，无机盐质量百分比为0.01％～0.1％，维生素质量百分比为0.0000001％～0.01％；摇瓶发酵采用1％～4％的碳酸钙作为酸的中和剂，于摇床上进行发酵，转数为180～200rpm，发酵温度为29℃；发酵时间为72小时；

3)发酵罐中发酵：无菌操作，按5％～15％的接种量将摇瓶发酵培养好的种子接种于发酵罐中进行发酵，发酵培养基成分同步骤2)，发酵温度为29℃；发酵时间为40～55小时；发酵罐中的通气量为0.6～1.0vvm；通过流加5～8M NaOH、5～8M工业氨水或液氨作为丙酮酸的中和剂，维持发酵体系的pH5～6.5，保证菌体生长、繁殖与代谢发酵的正常进行；

4)在发酵罐中进行酵母发酵生产丙酮酸，发酵结束，得上清液，其中含有目的产物丙酮酸至少0.5M，以丙酮酸钠计，质量百分含量5.5％以上。