[发明专利]固体发酵生产纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用廉价固体原料通过固体发酵生产固体纤维 素酶、木聚糖酶、纤维二糖酶复合酶的方法。

背景技术

纤维质原料中纤维素、半纤维素、木质素分别占30-40％、15-30 ％、10-20％。纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是地球上 最为丰富的可再生性天然资源。据估计，地球上纤维素中所蕴藏的能 量大约相当于6400亿吨的石油所含的能量，而且纤维素的可再生性 是石油等矿质能源所不可比拟的。充分利用纤维素酶处理纤维素，有 可能从根本上解决人类所面临的能源与粮食问题，其深远影响是不可 低估的。然而，目前约80％纤维素未被开发利用，具有极为诱人的 前景。

木聚糖在植物细胞壁中的含量仅次于纤维素，是半纤维素中含量 最丰富的一种。木聚糖是由D-木糖主链(以β-1，4键相连)和L-阿拉伯 糖分枝(a-1，2和a-1，3相连)所组成的聚合物。半纤维素木聚糖在木质 组织中占总量的50％，它结合在纤维素微纤维的表面，并且相互连接， 这些纤维构成了坚硬的细胞相互连接的网络。这种坚硬的网络阻碍了 纤维素酶对纤维素吸附，从而影响了纤维素的降解速率。

在天然纤维素水解成葡萄糖的过程中，必须依靠3种组分的协同 作用才能完成。纤维素大分子首先在C1酶和Cx酶的作用下逐步降 解成纤维二糖，而纤维二糖酶则进一步将纤维二糖水解成2个葡萄 糖。由于高浓度的纤维二糖对C1酶和Cx酶活力有强烈的抑制作用， 而在低浓度时则是纤维素酶的诱导物，如果纤维素酶复合组分中缺乏 纤维二糖酶组分就会严重影响纤维素的降解速率。

由于所使用的黑曲霉是高产木聚糖酶和纤维二糖酶的菌株，而绿 色木霉生产木聚糖酶和纤维二糖酶的能力较弱。故在发酵过程中，通 过木聚糖酶对木聚糖的水解可以降低其和纤维素的连接，从而增加了 纤维素酶对纤维素吸附。而纤维二糖酶则水解产生的纤维二糖，使纤 维二糖的含量在发酵过程中处于低浓度水平，从而诱导纤维素酶降解 纤维素。

发明内容

本发明的目的是针对纤维质原料发酵时利用率低、酶组成单一的 不足，提供一种操作简便，成本低，酶活力高，酶组分配比合理的固 体发酵生产纤维素酶、木聚糖酶、纤维二糖酶的固体复合酶的方法。

一种固体发酵生产纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶的方法，采 用绿色木霉、黑曲霉为生产菌种，分别培养得到绿色木霉液体种子和 黑曲霉麸曲种子，然后将绿色木霉液体种子接入固体发酵培养基培养 3-8天后，再将黑曲霉麸曲种子的孢子洗下后接入正在培养的固体发 酵培养基中继续培养8-12天，得同时含有纤维素酶、木聚糖酶和纤维 二糖酶的固体复合酶。

本发明所用绿色木霉(Trichoderma viride)，优选保藏号为ACCC 30206的绿色木霉，可从中国农业微生物菌种保藏管理中心获得；也 可以使用其它产纤维素酶的绿色木霉或里氏木霉；黑曲霉(Aspergillus niger)优选保藏号为CGMCC 3.3147的黑曲霉，也可以使用其它产 木聚糖酶和纤维二糖酶的黑曲霉。以绿色木霉菌株在玉米芯等农林废 弃物上进行培养，一段时间后接入黑曲霉进行混菌培养。

本发明的方法，其中用于培养所述绿色木霉液体种子的种子培养 基按重量计为葡萄糖1-3％、玉米浆1-3％、尿素1-3％、硫酸铵0.5-2％、 磷酸二氢钾0.2-2％，硫酸镁0.2-1％，其余为水；用于培养所述黑曲 霉麸曲种子的麸曲瓶培养基按重量计为麸皮35-45％、玉米芯50-65％、 尿素1-3％、硝酸铵1-3％、磷酸二氢钾0.5-2％。

本发明的方法，其中所述固体发酵培养基含麸皮、玉米芯、尿素、 硝酸铵或硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钴。优选配方为：重量 百分比的玉米芯60-70％；麸皮25-40％；硫酸铵1-8％；尿素1-5％； 磷酸二氢钾1-5％；碳酸钙1-5％；硫酸镁0.1-0.5％；氯化钴0.01-0.1％； 初始pH5.0-7.0。

本发明的方法，其中将绿色木霉先接入种子培养基中，在20-30 ℃下条件培养48小时，再接入固体发酵培养基；将黑曲霉先接入麸 曲瓶中，在20-30℃下条件培养4-8天，待绿色木霉接种培养3-8天 时再以营养盐水洗下孢子接入正在培养的固体发酵培养基中继续培 养8-12天。