[发明专利]一种蛹虫草菌种的培养方法

说明书

技术领域

本发明属于蛹虫草栽培技术领域，涉及一种蛹虫草菌种筛选和复壮的方法。

背景技术

蛹虫草Cordyceps militaris(L.ex Fr)Link，又名北冬虫夏草、北虫草，寄生在鳞翅目、鞘翅目、双翅目等昆虫蛹体上。生长在低海拔的平原地域，主要分布在东北、华北、西北等地。现代研究表明，蛹虫草含有虫草素(3’-脱氧腺苷)、虫草酸(D-甘露醇)、腺苷、虫草多糖、麦角甾醇、超氧化物歧化酶(SOD)、硒(Se)等化学成分。具有提高人体免疫功能、抗癌、抗菌、抗疲劳、抗衰老、抗惊厥、耐缺氧、镇静、壮阳固肾等作用。同时还具有减肥、瘦身、美容等功效。

蛹虫草与冬虫夏草Cordyceps sicinese为同属真菌，其化学成分和药理作用基本相同，临床上常将蛹虫草作为冬虫夏草的替代品入药。随着对虫草认识不断深入，不仅国内市场对虫草的需求日趋扩大，而且东南亚、日本、美国等国际市场的需求量也在增加。

由于自然资源的限制，市场上冬虫夏草供不应求，而且冬虫夏草已列入国家一级保护，禁止采挖。蛹虫草虽然在自然界的分布区域较广，但数量稀少，自然资源非常匮乏，远不能满足人们的需求。

在实际的蛹虫草规模化生产的菌种分离和筛选过程中，最常采用的是组织分离法。组织分离法就是指通过子实体组织分离获得纯菌丝的方法。食用菌的子实体实际上就是菌丝体的纽结物，它具有很强的再生能力。因此，只要切取一小块子实体组织，把它移植到培养基上，就能获取纯粹的菌丝体。

组织分离培养，从生物学的角度来看，乃是一种无性繁殖，是从组织-菌丝-组织-菌丝周而复始的循环过程，遗传变异小，但在无性繁殖过程中可能产生自然变异和突变，但组织分离产生的变异不很大，是一种累积、渐进的过程，变异是绝对的，稳定是相对的。

孢子分离法是利用食用菌成熟的有性孢子即担孢子、子囊孢子，无性孢子即厚垣孢子、节孢子、粉孢子等萌发成菌丝，来获得纯菌种的一种方法。由于孢子的数量大，变异的机会多，因此采用孢子分离法，可以有更多选择优良菌株的机会，而且孢子的生活力强，所得菌种菌龄小，生活力旺盛。但是有些食用菌的担孢子不易萌发成菌丝，还有些食用菌的孢子有两种或四种极性，单孢分离的菌株有时不产生子实体，必须经过交配，得到结实性的双核菌丝，才能用于产生。故孢子分离法又有单孢分离法和多孢分离法两种。

多孢分离法就是把许多孢子接种在同一培养基上，让它们萌发，自由交配来获得食用菌纯菌种一种方法。多孢分离实际上是多孢子间布朗运动、随机重组的结果，孢子是食用菌生活史中最年轻的起点。因此既可能孕育高产基因，也可能产生劣质组合。

因孢子在形成时，经减数分裂后，会发生基因的分离和重组，孢子基因类型众多。孢子萌发后，各种能亲和的菌丝发生交配，形成多种有差异的双核菌丝类型，在遗传特性上与原来母体不相同。因此，多孢分离得到的菌丝体是杂混的基因群体，不同于亲本，并有多种基因类型，从而不是一种纯菌种，多孢分离种可能产生生产性能最好的新组合。

发明内容

本发明的目的是提供一种蛹虫草菌种的培养方法，该方法采用多孢子分离法，周期短、操作简单可获得优良重组菌株。

本发明是利用多孢子分离法通过液体摇瓶震荡增殖过程中进行菌丝交配，然后进行静止培养获得生产性能好的高产子实体，并通过组织分离法保留高产菌种的优良生产性状。

为了实现本发明目的，本发明的一种蛹虫草菌种的培养方法，其包括如下步骤：

1)多孢的获得

将蛹虫草无性阶段的分生孢子和/或蛹虫草有性阶段子实体形成的子囊孢子作为培养的蛹虫草多孢；

2)多孢的增殖培养

采用PDA液体培养基对多孢进行震荡培养，培养温度16-25℃，转速100-140rpm，避光培养120-240小时，得多孢菌丝球；

3)菌丝球的破碎

将多孢菌丝球在均质机中转速1000-20000rpm下粉碎处理5-20min；

4)静止液体培养

然后将粉碎后的菌种接入到静止液体培养基中，摇匀后静止培养20-45天；

5)优良菌种的获得

当液体培养基表面出现子实体时，通过组织分离的方式获得优良菌株。

其中，步骤1)中，所述蛹虫草无性阶段的分生孢子的获得：采用退化或新分离获得的蛹虫草斜面或平板，光照培养，使斜面或平板菌落形成大量分生孢子。

获得的分生孢子可用无菌水洗涤，并进行收集。