[发明专利]检测人TBP-2基因表达的Taqman探针荧光定量PCR方法无效

专利信息
申请号: 200910094171.4 申请日: 2009-03-09
公开(公告)号: CN101985649A 公开(公告)日: 2011-03-16
发明(设计)人: 白洁;冯月梅 申请(专利权)人: 昆明理工大学
主分类号: C12Q1/68 分类号: C12Q1/68;G01N21/64
代理公司: 昆明今威专利代理有限公司 53115 代理人: 赛晓刚
地址: 650093 云南省昆明*** 国省代码: 云南;53
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摘要:
搜索关键词: 检测 tbp 基因 表达 taqman 探针 荧光 定量 pcr 方法
【权利要求书】:

1.一种检测人TBP-2基因表达的Taqman探针荧光定量PCR方法,其特征在于包括设计合成TBP-2引物和Taqman探针,提取细胞总RNA,反转录得cDNA,确定最佳退火温度Tm值、最佳引物浓度、最佳探针浓度的TaqmanPCR反应体系,以cDNA为标准品建立标准曲线。

2.根据权利要求书1所述的方法,其特征在于TBP-2的两条引物F/R和Taqman探针分别为:

F:GGATCCCAGCAGTGCAAAC

R:AAGCCGAACTTGTACTCATATTTGT

Probe:AGTACCTGCGCTATGAAGACACGCTT

3.根据权利要求书1所述的方法,其特征在于最佳退火温度Tm值的确定是以cDNA为模板进行扩增,反应体系为:Premix Taq Buffer 12.5μl、H2O 10.5μl、TBP-2F/R各0.5μl,cDNA 1μl;反应条件为:95℃2min;95℃30s,(55℃、57℃、59℃、61℃)30s,72℃1min,40个循环;72℃5min;4℃1min,扩增产物用1.5%琼脂糖电泳检测,通过电泳检测确定Tm为59℃。

4.根据权利要求书1所述的方法,其特征在于最佳引物浓度的确定是在扩增条件相同情况下,以能够检测到的最低浓度的cDNA模板,扩增产物条带清晰,无非特异性扩增为引物选择标准;分别设50nM、100nM、200nM、400nM四个不同梯度的TBP-2引物浓度,用同一浓度cDNA为模板,同时进行PCR检测;反应体系为25μl:Premix Taq Buffer 12.5μl、TBP-2F/R各0.5μl、H2O 10.5μl、cDNA 1μl混合均匀进行普通PCR扩增;反应条件为:95℃2min;95℃30s,59℃30s,72℃1min,40个循环;72℃5min;4℃1min;扩增产物用1.5%琼脂糖电泳检测,确定最佳引物浓度为200nM。

5.根据权利要求书1所述的方法,其特征在于最佳探针浓度的确定是以相同模板和引物浓度下循环域值(Ct)最小、荧光信号比(Rn)活度最大为探针选择标准;采用50nM、100nM、200nM 3个探针浓度,分别用于同一浓度cDNA为模板,进行TaqMan PCR检测;反应体系为25μL:Realtime PCR Master Mix 12.5μL、TBP-2F/R各0.5μL、Probe 0.5μl、H2O 10μL、cDNA 1μl混合均匀;反应条件为:95℃2min;95℃30s,59℃30s,72℃1min,40个循环;72℃5min;4℃1min;结果确定最佳探针浓度为100nM。

6.根据权利要求书1所述的方法,其特征在于标准曲线的建立是利用反转录的cDNA的一个样品作为标准品,进行四倍浓度梯度稀释,得5个浓度的标准品1,1/4,1/16,1/64,1/256,根据反应结果中样品浓度对数值及其Ct值的对应关系得出定量标准曲线。

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