[发明专利]检测人TBP-2基因表达的Taqman探针荧光定量PCR方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种检测人TBP-2基因表达的Taqman探针荧光定量PCR方法。

背景技术

实时荧光定量PCR是美国PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。该技术的原理是：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’端-3’端外切酶活性将探针切开，使报告荧光基团游离出来，发出荧光信号，从而可被荧光监测系统检测到，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。与普通PCR相比，实时荧光定量PCR具有特异性强，灵敏度高，准确性好等优点，目前已应用于分子生物学研究范畴。

硫氧还蛋白结合蛋白-2(thioredoxin-binding protein-2，TBP-2)在酵母双杂交实验中被鉴定与还原的硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)结合，从而抑制Trx的活性。TBP-2在生物体内具有多种生物学功能，如调节细胞内氧化还原反应、与细胞的增殖、分化、凋亡、老化等有关。癌症组织中TBP-2的表达量减少，TBP-2高表达可以抑制肿瘤组织的生长，故可被看作是一个抑癌基因。TBP-2还与葡萄糖代谢、脂肪代谢密切相关。因此，对TBP-2的研究，在对许多疾病的发病机理及防治上都具有非常重要的意义。

现有检测技术中未涉及该专利所用的检测人TBP-2基因表达的引物及Taqman探针序列。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种检测人TBP-2基因表达的Taqman探针荧光定量PCR的方法，利用该方法，对组织和细胞中TBP-2的表达及变化情况进行检测，可以准确、快速、灵敏地检测出人TBP-2的表达及变化情况，具有良好的重复性和稳定性，可以反应基因mRNA水平。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

一种检测人TBP-2基因表达的Taqman探针荧光定量PCR方法，包括设计合成TBP-2引物和Taqman探针，提取细胞总RNA，反转录得cDNA，建立确定最佳退火温度Tm值、最佳引物浓度、最佳探针浓度的Taqman PCR反反应体系，以cDNA为标准品建立标准曲线。

其中，TBP-2的两条引物F/R和Taqman探针分别为：

F：GGATCCCAGCAGTGCAAAC

R：AAGCCGAACTTGTACTCATATTTGT

Probe：AGTACCTGCGCTATGAAGACACGCTT

最佳退火温度Tm值的确定是以cDNA为模板进行扩增，反应体系为：PremixTaq Buffer 12.5μl、H₂O 10.5μl、TBP-2 F/R各0.5μl，cDNA 1μl；反应条件为：95℃ 2min；95℃ 30s，(55℃、57℃、59℃、61℃)30s，72℃ 1min，40个循环；72℃ 5min；4℃ 1min，扩增产物用1.5％琼脂糖电泳检测，通过电泳检测确定Tm为59℃。

最佳引物浓度的确定是在扩增条件相同情况下，以能够检测到的最低浓度的cDNA模板，扩增产物条带清晰，无非特异性扩增为引物选择标准；分别设50nM、100nM、200nM、400nM四个不同梯度的TBP-2引物浓度，用同一浓度cDNA为模板，同时进行PCR检测；反应体系为25μl：Premix Taq Buffer 12.5μl、TBP-2 F/R各0.5μl、H₂O 10.5μl、cDNA 1μl混合均匀进行普通PCR扩增；反应条件为：95℃ 2min；95℃ 30s，59℃ 30s，72℃ 1min，40个循环；72℃ 5min；4℃ 1min；扩增产物用1.5％琼脂糖电泳检测，确定最佳引物浓度为200nM。